[发明专利]一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法

权利要求书

1.一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，将待测全血样本制备成溶血液，用重组羧肽酶B将溶血液酶解，然后用HPLC-MS/MS进行分离定量分析，并以HbA₀二肽标准品和HbA_1c二肽标准品的混合物作为校准品，用HPLC-MS/MS进行分离定量分析，绘制标准曲线，用待测全血样本中的HbA_1c二肽和HbA₀二肽的峰面积值，通过标准曲线计算得出待测全血样本中的HbA_1c和HbA₀二肽的浓度，再用以下计算公式计算得到待测全血样本中的HbA_1c的含量，单位为质量百分数，计算公式为：待测全血样本中的HbA_1c的含量=HbA_1c二肽/( HbA_1c二肽+ HbA₀二肽) ×100%，公式中，HbA_1c二肽表示待测全血样本中HbA_1c二肽的浓度，HbA₀二肽表示待测全血样本中HbA₀二肽的浓度；

所述HPLC-MS/MS分析中采用以下色谱条件和质谱条件：

色谱条件：色谱柱： ZORBAX SB-CN，2.1 mm×150mm，5µm，柱温：35℃，流动相A：0.2%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，进样量：1μL，流速：0.35mL/min，流动相比例：95%B, 5%A等度洗脱，洗脱时间为4.5min；

质谱条件：离子源模式为ESI源正离子模式，扫描方式：RMR，雾化气流量：3 L/min；加热气流量：10 L/min；接口温度：350℃；DL温度：150℃；加热块温度：350℃；干燥气流量：10 L/min。

2.根据权利要求1所述的全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，所述待测全血样本制备成溶血液过程包括：用移液枪移取100 μL全血样本于1.5mL塑料离心管中，于5600 r/min 8℃离心10 min后弃血浆，取出弃血浆后的血细胞10 μL于新的1.5 mL塑料离心管中，加入10 μL纯水后1500 r/min匀30s，再加入200μL储备缓冲溶液后于1500 r/min旋混匀1 min即制成溶血液；

所述储备缓冲溶液按如下方法配制而得：移液器取1mol/Lβ吗啉乙磺酸溶液， 0.5mol/L碳酸氢钠溶液， 1mol/L Na₂-EDTA溶液，加纯水定容至100 mL混匀，使β吗啉乙磺酸终浓度为50mmol/L、NaHCO₃终浓度为25mmol/L、Na₂-EDTA终浓度1mmol/L，_PH值为6.2即为储备缓冲溶液。

3. 根据权利要求1所述的全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，所述用重组羧肽酶B将溶血液酶解过程包括：将盛有溶血液的塑料离心管于12000 r/min高速离心10 min后，取出5 µL上层液于另一支新的1.5mL塑料离心管中，加入15 μL浓度为 200µg/mL的重组羧肽酶B溶液，加入200μL消化缓冲溶液于37℃水浴2h，再于-20℃冻存10min后取100 µL 溶液进行HPLC-MS/MS分离定量分析，进样量为1μL；

所述消化缓冲溶液按如下方法配制而得：

精密称量碳酸氢钠1.68g，置于15mL离心管中，加入10mL纯水溶解，振荡混匀，得到2mol/L碳酸氢钠溶液，移液器取2 mol/L碳酸氢钠溶液2.5 mL加纯水定容至100mL，混匀，测量其_PH，用乙酸调节其_PH值到8.0即为消化缓冲溶液，4℃保存。