[发明专利]纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了纯化CR2‑crry重组蛋白的制备方法，涉及重组蛋白制备纯化技术领域，该纯化CR2‑crry重组蛋白的制备方法，包括基因筛选→基因重组→基因克隆→克隆筛选→蛋白表达→蛋白纯化，CR2‑crry重组蛋白作为目的蛋白，纯化包括以下步骤：S1：发酵表达，通过过滤固液分离收集发酵液，浓缩，S2：加入蛋白酶抑制剂，采用PEI沉淀法分开目的蛋白和其他细胞成分，首先在低盐浓度下沉淀核酸以及含有目的蛋白的组分，经过低盐浓度缓冲液的洗杂步骤后，使用高盐缓冲液将目的蛋白从沉淀中复溶，再经过硫酸铵沉淀的方式沉淀目的蛋白，含有的PEI保持在上清液中，最后将沉淀用缓冲试剂复溶得到含有目的蛋白的粗纯样品。解决了CR2‑crry重组蛋白构建和高效纯化的问题。

技术领域

本发明涉及重组蛋白制备纯化技术领域，具体为纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法。

背景技术

重组蛋白是应用基因重组技术，将可以翻译成目的蛋白的基因片段整合到重组表达载体中，再将整合后的重组表达载体转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子。

随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。

产生的重组蛋白作为生物制药的产物，在医学中作用显著，不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异纯化，结合重组蛋白制备，我们提供了纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

本发明提供了纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，解决了CR2-crry重组蛋白构建和高效纯化的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，包括基因筛选→基因重组→基因克隆→克隆筛选→蛋白表达→蛋白纯化，CR2-crry重组蛋白作为目的蛋白，纯化包括以下步骤：

S1：发酵表达，通过过滤固液分离收集发酵液，浓缩；

S2：加入蛋白酶抑制剂，采用PEI沉淀法分开目的蛋白和其他细胞成分，首先在低盐浓度下沉淀核酸以及含有目的蛋白的组分，经过低盐浓度缓冲液的洗杂步骤后，使用高盐缓冲液将目的蛋白从沉淀中复溶；

再经过硫酸铵沉淀的方式沉淀目的蛋白，含有的PEI保持在上清液中，最后将沉淀用缓冲试剂复溶得到含有目的蛋白的粗纯样品；

S3：超滤处理，利用离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，蛋白质留在膜上，选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质，去除颗粒物，净化，用于层析纯化，净化后立即使用；

S4：通过Heparin亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析以及分子筛中的一种或几种方式组合进一步纯化。

优选的，在步骤S1中，所述发酵参数为：pH5.0，温度29℃，溶氧控制大于30％。

优选的，在步骤S1中，所述过滤用的过滤组件为0.22μm中空纤维膜超滤。

优选的，为了将CR2连接到crry，使用链接序列编码(GGGGS)₂，采用标准pcr方法制备基因构建物。

优选的，所述基因克隆步骤在PBM载体中进行，PBM载体也用于蛋白表达。