[发明专利]纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法

权利要求书

1.纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括基因筛选→基因重组→基因克隆→克隆筛选→蛋白表达→蛋白纯化，CR2-crry重组蛋白作为目的蛋白，纯化包括以下步骤：

S1：发酵表达，通过过滤固液分离收集发酵液，浓缩；

S2：加入蛋白酶抑制剂，采用PEI沉淀法分开目的蛋白和其他细胞成分，首先在低盐浓度下沉淀核酸以及含有目的蛋白的组分，经过低盐浓度缓冲液的洗杂步骤后，使用高盐缓冲液将目的蛋白从沉淀中复溶；

再经过硫酸铵沉淀的方式沉淀目的蛋白，含有的PEI保持在上清液中，最后将沉淀用缓冲试剂复溶得到含有目的蛋白的粗纯样品；

S3：超滤处理，利用离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，蛋白质留在膜上，选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质，去除颗粒物，净化，用于层析纯化，净化后立即使用；

S4：通过Heparin亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析以及分子筛中的一种或几种方式组合进一步纯化。

2.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述发酵参数为：pH5.0，温度29℃，溶氧控制大于30％。

3.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述过滤用的过滤组件为0.22μm中空纤维膜超滤。

4.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：为了将CR2连接到crry，使用链接序列编码(GGGGS)₂，采用标准pcr方法制备基因构建物。

5.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述基因克隆步骤在PBM载体中进行，PBM载体也用于蛋白表达。

6.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：通过限制稀释法筛选稳定转染的克隆，通过ELISA法定量检测克隆蛋白的表达。

7.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，加入DNA酶，降解DNA。

8.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S4中，所述离子交换层析的填料为球形，且粒径分布均一。

9.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S4中，所述凝胶过滤层析的填料为葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶的分层多层组合层。

10.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述纯化CR2-crry重组蛋白在使用前放入-80℃温度下冷冻。