[发明专利]含有AIF1细胞因子抗体的小球藻及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及含有AIF1细胞因子抗体的小球藻及其制备方法和应用。本发明采用纯化出来的近江牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白制品标记FITC荧光标记，以pVEC穿膜肽为载体将AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻，在室温黑暗条件下，进行AIF1细胞因子抗体孵育小球藻，从而获得含有AIF1细胞因子抗体分子物质成分的小球藻种类。用抗体分子免疫荧光标记生物学技术、激光共聚焦显微镜检测、验证小球藻体内含有牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白质成分及其含量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及含有AIF1细胞因子抗体的小球藻及其制备方法和应用。

背景技术

“蓝色海洋产业”是当今人类解决人口过剩与陆地资源短缺这一矛盾的重要源泉，但随着海水养殖产业(包括贝类、虾类和鱼类养殖产业)的发展，海水养殖病害的暴发和流行给海水养殖产业的发展以极大的打击，成为这一产业发展的“瓶颈”制约因素。因此，人们迫切地需要解决下列两个重大的问题：即病害的“防”与“治(或曰控制)”，而解决“防”与“控制”的关键就是：一要解决流行病的快速检测问题，做到疾病暴发前的早诊断；二要解决养殖动物自身抵抗力的问题即免除病原感染，降低养殖动物群体的大规模死亡。国际上应用分子生物学技术(包括分子免疫学)防治海水养殖动物病害是当今国内外海水养殖病害研究的主攻发展方向，这些技术包括各种分子及免疫快速检测技术、各种分子疫苗技术、各种细胞或免疫因子、基因工程技术等。但是，目前国内外尚未有采用高效价细胞因子抗体技术来获得贝类、虾类和鱼类养殖产业生产中抗病的免疫饵料及抗菌微生态免疫制剂制备的技术和产品。

我们前期对AIF1对革兰氏阴性菌成份LPS和类立克次氏体(RLO)抗感染的研究显示：牡蛎AIF1(Ca-AIF1)多克隆兔抗血清能显著抑制类立克次氏体(RLO)和LPS刺激引起的炎症相关因子LITAF的表达(LPS+anti-Ca-AIF1，1.5-12小时分别降低70.95％，84.18％，39.49％和87.53％；RLO+anti-Ca-AIF1，1.5-12小时分别降低88.57％，84.80％，59.36％和59.16％)，说明Ca-AIF1多克隆抗血清具有有效抑制RLO感染和革兰氏阴性菌引起的炎症反应的作用。再比如，Ca-AIF1抗血清能够显著抑制RLO感染和革兰氏阴性菌引起的细胞凋亡和细胞坏死，显著增加细胞存活率，RLO+anti-Ca-AIF1实验组和LPS+anti-Ca-AIF1实验组活细胞数分别增加了51％和49％；而晚期凋亡细胞率分别减少了约50％和18％。

发明内容

针对上述现有技术中存在的缺乏，本发明提供了含有AIF1细胞因子抗体驯化培养小球藻及其制备方法。

一种含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。

含有AIF1细胞因子抗体的小球藻的制备方法，采用纯化出来的近江牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白制品标记FITC荧光标记，以pVEC穿膜肽为载体将AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻，在室温黑暗条件下，进行AIF1细胞因子抗体孵育小球藻，从而获得含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。

其中，AIF1细胞因子抗体的制备包括如下步骤：

1)以近江牡蛎血淋巴细胞总RNA为模板，反转录成一链cDNA，克隆获得AIF1基因的编码框核苷酸序列；

2)将AIF1基因编码框的序列片段克隆到pMD19-T载体中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-32(a)原核表达载体连接，获得重组表达质粒pET-32(a)-AIF1；

3)将阳性重组质粒PET-32(a)-AIF1转化到表达宿主菌E.coli Rossetta(DE3)，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测；

4)将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质；

5)将纯化的AIF1蛋白多点注射新西兰大白兔，制备纯化多克隆抗体。