[发明专利]一种病原体现场核酸检测的装置及使用方法

说明书

本发明涉及一种病原体现场核酸检测的装置及使用方法，属于实验室用设备技术领域，所述装置包括基座和设置在基座上的核酸提取部、检测部、显示部和控制装置；使用本发明装置结合配套的RPA‑LFD方法，能够快速获得更灵敏、更特异的检测结果；该装置的检测部和显示部均密封，不开盖即可完成扩增反应和检测，可防止高浓度核酸扩增产物导致的污染，实验完成后，可将该装置的检测部和显示部整体丢弃，可降低生物安全风险；该装置可脱离对实验室和贵重仪器的依赖，能够在动物养殖场等场所进行现场核酸提取和检测。

技术领域

本发明属于实验室用设备技术领域，具体地涉及一种病原体现场核酸检测的装置及使用方法。

背景技术

核酸检测技术尤其是近年来发展的实时荧光PCR，灵敏度高，特异性强，目前在临床已经大规模的应用，获得了广泛的认可。但是，由于该方法高度依赖实验室环境，比如核酸提取的过程中需要高速离心机，荧光PCR过程中需要精密的热循环仪，读取结果需要专业的技术人员，核酸提取和PCR所需时间较长，难以满足现场检测的需要。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplication，RPA)是一种新型恒温核酸扩增技术，与PCR相比，操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、无需精密仪器，是一种可以替代PCR的核酸检测技术，是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具。RPA与横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD) 结合(RPA-LFD)是一项将重组酶聚合酶扩增、胶体金标记(三明治夹心法)、分子杂交和侧向流层析等方法相结合的，结果可视化的核酸检测技术。研究中使用nfo为核酸外切酶IV，其检测原理为，首先上游引物和含有3’端生物素 (biotin)标记的下游引物扩增出的扩增子，和含有羧基荧光素(FAM)标记的特异性探针杂交反应，形成5’端为FAM标记，3’端为生物素标记的产物。将该产物加到侧向流动试纸条的样品孔中，通过毛细作用层析至结合垫(固定有标记抗FAM抗体的胶体金颗粒)，该产物中的5’端FAM与抗FAM抗体的胶体金颗粒结合形成复合物，该复合物层析到检测线(T线)时，因T线固定有链霉亲和素(SA)，含有生物素标记的扩增产物被链霉亲和素捕获显红色，没有被捕获的复合物继续向上层析至质控线(C线)时，因C线固定有特异性抗体，被特异性抗体捕获显红色，结果为阳性。该方法15-30分钟即可实现扩增产物的可视化检测，而荧光定量PCR则需要1-2小时，因此，RPA-LFD为实现病原体现场快速检测提供了一种新的方法。

现场核酸检测需要解决三个关键问题，包括：样品准备、扩增及检测，而样品准备是其中最大的挑战。在常规提取核酸的方法中，包括离心柱法和TRIzol 法等，都离不开加热仪器(包括水浴锅或干浴锅)和高速离心机等。而用常规磁珠法来提取核酸时，需要加热仪器、旋转仪和磁力架等。上述方法都难以脱离实验室环境，不易实现现场提取核酸。因此，需要一套简易、便携的装置，满足现场核酸提取的需要。

由于RPA是一种扩增效率不亚于荧光定量PCR的核酸扩增方法，扩增产物浓度非常高，在开管盖﹑取样﹑上样以及样本在侧向流动试纸条上层析的过程中，气体与样本液面摩擦时，容易产生核酸气溶胶污染，在下一次检测时，由于该方法的高灵敏度，极少量的气溶胶分子即可以被扩增出，导致假阳性结果和潜在的生物安全风险。因此，有必要使该扩增反应和检测反应在密闭装置中完成，检测完成后，将反应部分和检测部分整体丢弃处理，以降低假阳性结果和生物安全风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种病原体现场核酸提取和检测的装置及使用方法。所述装置结合配套的RPA-LFD方法，能够简单快速地提取核酸，有效防止开管盖造成的假阳性和生物安全风险，快速获得更灵敏、更特异的检测结果；该装置的检测部和显示部均密封，不开盖即可完成扩增反应和检测，可防止高浓度核酸扩增产物导致的污染，实验完成后，可将该装置的检测部和显示部整体丢弃处理，降低生物安全风险；该装置可脱离对实验室和贵重仪器的依赖，能够在动物养殖场等场所进行现场核酸提取和检测。

本发明采用的技术方案为：