[发明专利]一种酶活提高及最适pH改变的NADH氧化酶突变体

说明书

本发明公开了一种酶活提高及最适pH改变的NADH氧化酶突变体，属于基因工程技术领域。本发明提供的NADH氧化酶突变体N20D、Y66D、N116E、N20D/Y66D、N20D/N116E均能够实现在中性条件下酶活提高的技术效果，并且，NADH氧化酶突变体N20D/N116E的最适pH从9.0下调到了7.0，比酶活也得到显著提升，在pH 7.0时比酶活可达9.19U/mg蛋白，是野生型的2.9倍，加强了该酶再生NADsupgt;+/supgt;的能力，为工业化氧化还原酶催化提供了一种实际有效的辅酶再生策略。

技术领域

本发明涉及一种酶活提高及最适pH改变的NADH氧化酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

如今工业生物催化已成为生物技术领域中具有良好发展前景的新兴研究方向之一。酶作为一种重要的催化剂，在工业催化中扮演着关键性的角色。据统计，只有15％已被发现与研究的酶被应用于工业，其中氧化还原酶作为占比最大的一类酶，在工业生物催化领域具有重要的应用价值。目前已知绝大部分的氧化还原酶在催化过程中需要辅酶(NAD(P)⁺/NAD(P)H)参与电子传递以促进底物的转化。然而，辅酶价格较高、在溶液中不稳定、重复利用率极低，在催化反应体系中添加大量辅酶将极大增加反应成本，这也导致氧化还原酶的进一步工业应用被严重限制。因此，构建高效、环保和低成本的辅酶再生系统对工业生物催化的发展具有重要意义，也可以解决工业应用中辅酶成本高和利用率低等难题。

NADH氧化酶(NOX酶)广泛存在于各种生物体内，可直接消耗溶解氧以催化氧化NADH生成NAD⁺，因此可应用于NAD⁺的再生研究。同时产H₂O型NADH氧化酶除了具有高效催化的特点，由于其催化产物是水，无副产物生成，环境友好和操作简单，在工业中具有较大的应用潜力。但目前的NADH氧化酶的最适反应pH较高，多依赖强碱的反应环境，在中性条件下酶活较低，这一缺陷无疑会使其作为再生系统的使用范围受限。

发明内容

为了解决现有技术中NADH氧化酶的最适反应pH较高，多依赖强碱的反应环境，在中性条件下酶活较低等技术问题，本发明提供了一种NADH氧化酶突变体，本发明的NADH氧化酶突变体在温和条件下的酶活提高，能够提高NAD⁺再生系统的反应效率，同时降低反应成本。

本发明的突变体是将氨基酸序列如SEQ I D NO.1所示的NADH氧化酶的第20位的天冬酰胺突变为天冬氨酸得到的；命名为N20D；

或所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NADH氧化酶的第66位的酪氨酸突变为天冬氨酸得到的；命名为Y66D；

或所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NADH氧化酶的第116位的天冬酰胺突变为谷氨酸得到的；命名为N116E；

或所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NADH氧化酶的第20位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，同时将第66位的酪氨酸突变为天冬氨酸得到的；命名为N20D/Y66D；该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

或所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NADH氧化酶的第20位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，同时将第116位的天冬酰胺突变为谷氨酸得到的；命名为N20D/N116E；该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述NADH氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了编码上述NADH氧化酶突变体的基因。

本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pETDust系列载体作为出发载体。