[发明专利]高灵敏度的免疫检测方法及其应用

说明书

本发明公开了高灵敏度的免疫检测方法及其应用，该免疫检测方法包括以下步骤：提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，捕获抗体偶联于固态基质，检测抗体标记有核酸探针；将待测样本、捕获抗体、检测抗体混合反应，使待测样本中的待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体形成免疫复合物；将免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切核酸探针，并诱导产生对报告核酸的非特异性剪切，根据报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。该免疫检测方法在将CRISPR技术、免疫分析技术以及液滴微流控技术三者相结合，可以达到更显著的级联放大效果，降低了检出限，提高了灵敏度。

技术领域

本申请涉及分子检测技术领域，尤其是涉及高灵敏度的免疫检测方法及其应用。

背景技术

自上世纪60年代发明以来，免疫测试在实验和临床研究中发挥了很重要的作用。免疫分析几乎可以用于检测分析所有的生物分子，包括蛋白质、核酸、囊泡、小分子，甚至可以分析整个细胞。酶联免疫吸附分析(ELISA)从1971年第一次提出至今，已成为免疫学实验和临床研究最广泛使用的技术。ELISA基本原理和方法是将目标分子的特异性抗体固定到固体基质(微量反应板、微球、磁珠等)上，通过抗原抗体免疫吸附作用捕获目标分子，再连接酶标记的检测抗体用于催化后续检测反应产生颜色。通过酶促信号放大步骤，ELISA的检出限(LOD)可以达到0.01-50ng/mL水平(pM-nM)。凭借着酶促反应的信号放大，ELISA在常规诊断中发挥着很大的作用，然而，对于一些在人体中含量很低的生物标志物，例如跟癌症、心血管疾病、神经退行性疾病以及某些传染病早期诊断相关的生物标志物，ELISA就会暴露出其灵敏度不够的缺点，难以准确地检测出这些生物分子。另外，ELISA方法采用抗原抗体的特异性结合来识别捕获目标分子，再通过检测抗体的酶促反应来进行目标物的检测。但并非所有的抗体都适合进行酶标记。因此，有必要提供一种具有更高灵敏度的免疫检测方法。

规律间隔成簇短回文重复序列及其关联蛋白(CRISPR/Cas)体系是微生物在对抗外来病毒入侵的过程中形成的自适应免疫系统，该系统包含有可以编程的核酸内切酶，这使得CRISPR体系可以应用于疾病诊断领域。CRISPR体系在检测到目标DNA或RNA序列后，会将目标核酸分子附近的RNA或DNA序列剪切掉。根据这一原理，CRISPR体系在核酸检测中有着广泛的应用。而在免疫测定领域，虽然已有研究人员进行了初步探索，但检测的灵敏度仍然有待提高。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种具有更高高灵敏度的免疫检测方法。

本申请的目的还在于提供一种免疫检测试剂盒。

本申请的第一方面，提供免疫检测方法，该免疫检测方法包括以下步骤：

提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，捕获抗体偶联于固态基质，检测抗体标记有核酸探针；

将待测样本、捕获抗体、检测抗体混合反应，使待测样本中的待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体形成免疫复合物；

将免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切核酸探针，并诱导产生对报告核酸的非特异性剪切，根据报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。

根据本申请实施例的免疫检测方法，至少具有如下有益效果：

本申请实施例所提供的免疫检测方法将CRISPR技术、免疫分析技术以及液滴微流控技术三者相结合，利用捕获抗体捕获待测样本中的待检目标，再与标记核酸探针的检测抗体通过抗原抗体特异性结合形成免疫复合物，并作为单个的反应体系分散到液滴中去，以单独的液滴作为CRSIPR/Cas系统剪切反应的反应器，各个反应器相互隔离，以便后续对反应结果进行检测。通过这种方式，本申请实施例所提供的免疫检测方法可以达到更显著的级联放大效果，降低了待检目标的检出限，提高了检测灵敏度，有利于在临床中的应用。