[发明专利]一种基于光谱共焦原理的生物显微视觉预对焦装置及方法

权利要求书

1.一种基于光谱共焦原理的生物显微视觉预对焦装置，其特征在于该装置包括光谱共焦传感模块、显微光学模块、玻片夹持装置、聚焦运动装置和扫描运动装置；

光谱共焦传感模块包括色散镜头、宽光谱光源、光纤光路、光谱测量模块、控制系统；显微光学模块包括显微物镜、结像透镜、倍率转换镜、聚光镜、光源、数字摄像装置；玻片夹持装置用于固定标准生物玻片，保证标准生物玻片在水平运动时不发生滑移；聚焦运动装置用于实现驱动玻片夹持装置与显微物镜之间相互移动；扫描运动装置用于驱动玻片夹持装置在X-Y平面内运动，完成对标准生物玻片的扫描；

光谱共焦传感模块的量程在0.1mm到1.5mm之间；纵向分辨率小于0.2μm；

所述色散镜头用于将不同波长的光分别聚焦，实现对多色光的轴向色散；所述宽光谱光源由白光LED和准直透镜组成，产生多波长复合光；所述光纤光路由Y型光纤、导光光纤、光纤连接器组成；所述光谱测量模块包括第一透镜、光栅分光器、第二透镜、光探测传感器；所述控制系统由逻辑控制电路、光强驱控电路、数字信号处理器三部分组成；逻辑控制电路控制光探测传感器获取光谱信息；光强驱控电路控制所述宽光谱光源工作，并调节其发光强度；数字信号处理器将光谱信息转化为盖玻片上/下表面的距离、待观测生物组织层的厚度信息；

所述Y型光纤具有入光口、出光口、并束口三个端口，构成小孔共焦结构，其入光口接到所述宽光谱光源上，其出光口接到所述光谱测量模块的进光口，其并束口接到光纤连接器的一端；光纤连接器的另一端接导光光纤，导光光纤的另一端接所述色散镜头；

所述宽光谱光源发出的白光顺序经过所述Y型光纤的入光口、所述光纤连接器、所述导光光纤后，进入所述色散镜头后被分成不同波长的光，分别聚焦在不同的轴向位置；聚焦在盖玻片上表面、盖玻片下表面、组织上表面、组织下表面的光反射进入所述色散镜头，顺序经所述导光光纤、所述光纤连接器、所述Y型光纤并束口后，由所述Y型光纤的出光口进入所述光谱测量模块的进光口；进入所述光谱测量模块的光经所述第一透镜准直后，入射到所述光栅分光器上；所述光栅分光器将入射光按照波长不同以不同角度反射，并经所述第二透镜形成一条色散光束，最终入射到所述光探测传感器上；所述光探测传感器是线阵式探测器，采用CMOS或CCD图像传感器。

2.根据权利要求1所述的一种基于光谱共焦原理的生物显微视觉预对焦装置的实现方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1、标定确立显微物镜物方焦点和光谱共焦传感模块测量值之间的空间转换关系；

步骤2、获取标准生物玻片的整体预览图像，并在预览图像上生成若干个特征点；

步骤3、由扫描运动装置带动待测生物玻片在色散镜头下完成扫描运动，记录光谱共焦传感模块测量值及对应的X-Y平面位置坐标；

步骤4、利用通过步骤1确定的空间转换关系，将光谱共焦传感模块测量值转化为运动装置在显微物镜轴向上的聚焦位置f(x₀,y₀)，将步骤2记录的X-Y平面位置坐标P(x₀,y₀)转化为显微光学摄像时的X-Y平面位置坐标P(x,y)，将f(x₀,y₀)与P(x,y)一一对应，得到聚焦位置的集合f(x,y)；

步骤5、根据聚焦位置集合f(x,y)，利用克里金(Kriging)插值方法，拟合出待测生物玻片完整的聚焦地形图Z-Map(x,y)；

步骤6、根据聚焦地形图Z-Map(x,y)，同步控制扫描运动装置和扫描运动装置的位置，完成扫描，并通过数字摄像装置同步拍摄显微物镜的镜下视野图像。

3.根据权利要求2所述的一种基于光谱共焦原理的生物显微视觉预对焦装置的实现方法，其特征在于所述方法步骤1中，确立显微物镜物方焦点和光谱共焦传感模块测量值之间的空间转换关系的标定方法具有如下步骤：

步骤1-1、获取标定用生物切片的整体预览图像，预先设定N个特征标志点；

步骤1-2、调节色散镜头与标定用生物玻片的相对距离，使标定用生物玻片的盖玻片上表面和下表面回光的两个光谱波峰在所有特征标志点位置都在量程以内；

步骤1-3、由扫描运动装置带动标定用生物玻片，使各特征标志点逐一在色散镜头的光斑区域；由光谱共焦传感模块记录每个特征标志点对应的第一光谱波峰p₁、第二光谱波峰p₂、第三光谱波峰p₃、第四光谱波峰p₄对应的波长，将第n个特征标志点数据记录为L_n(p₁,p₂,p₃,p₄)[x₀,y₀]；

步骤1-4、由扫描运动装置带动标定用生物玻片，使各特征标志点逐一在显微物镜的视野下方；在每一个标志点，控制聚焦运动装置进行步进运动，使显微物镜和标定用生物玻片的距离由大到小变化；步数为M，通过数字摄像装置获取每个步进位置z的显微物镜下图像，计算对应图像的锐利度，将第n个特征标志点数据记录为S_n(z₁,z₂,z₃,…z_M)[x,y]；

步骤1-5、将每个特征标志点在步骤1-3和步骤1-4中的X-Y平面位置坐标[x,y]和[x₀,y₀]一一对应，通过基于RANSAC的鲁棒算法，计算[x,y]和[x₀,y₀]之间的单应型矩阵H，H是一个3×3的矩阵，则有：

步骤1-6、对每个特征标志点的聚焦图像锐利度数据S_n(z₁,z₂,z₃,…z_M)进行分析，找到值最大的两个峰P-S_n(z_m)和P-S_n(z_k)，且z_mz_k；使第一光谱波峰的波长L_n(p₁)与z_m一一对应，利用最小二乘法拟合确定公式z_m＝a L_n(p₁)+b中的待标定参数a和b；使第二光谱波峰、第三光谱波峰、第四光谱波峰对应的波长与z_k一一对应，利用最小二乘法拟合确定公式中的待标定参数c、d、e，确定公式如下：

z_k＝c[L_n(p₂)-L_n(p₁)]+d[L_n(p₄)-L_n(p₃)]+e+z_m；

待标定参数a、b、c、d、e具有如下特点：a、b在色散透镜或显微物镜的安装发生变化时才需要重新标定；c、d、e在 生物玻片的材质发生变化时才需要重新标定；当光谱共焦传感模块的量程是盖玻片厚度的20倍以上时，d取常数0；从使用角度，a、b的标定频率高于c、d、e的标定频率。