[发明专利]一种酶法制备嘌呤霉素的方法

说明书

本发明涉及药物合成技术领域，特别涉及一种酶法制备嘌呤霉素的方法。该方法包括如下步骤：3‑氨基‑D‑核糖在甲基硫核糖激酶与ATP作用下，生成β‑氨基核糖‑1‑磷酸；β‑氨基核糖‑1‑磷酸和N,N‑二甲基嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶作用下，生成3‑氨基‑N,N‑二甲基腺苷；3‑氨基‑N,N‑二甲基腺苷和甲基酪氨酸在氨基酸连接酶与ATP作用下，生成嘌呤霉素。本发明针对嘌呤霉素发酵及化学制备方法局限，开发了其酶法制备工艺。相对于传统路线，该工艺具有路线短、转化率高、反应条件温和、环保等优点，这不仅显著的降低了嘌呤霉素生产成本，同时也提高了其工业生产中安全及绿色指数。

技术领域

本发明涉及药物合成技术领域，特别涉及一种酶法制备嘌呤霉素的方法。

背景技术

嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌、各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌；常用于筛选通过质粒转染/转化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。嘌呤霉素不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。嘌呤霉素的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99％的不表达pac基因的细胞。在革兰氏阳性菌、动物或昆虫细胞中，嘌呤霉素通过抑制蛋白质合成而抑制或杀死细胞。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端。

嘌呤霉素的传统制备方法包含发酵法以及化学合成法：

1)发酵法：用白黑链霉菌发酵生产，但是产率太低，并且由于副产物多，所以纯化工艺复杂，生产成本高。

2)化学合成法：Morris J.Robins报道了化学法合成嘌呤霉素，用3-叠氮-腺苷作为原料，6步化学催化制备嘌呤霉素，总收率约为26％。嘌呤霉素的化学合成法制备需要对多个官能团进行保护及脱保护，整体路线长，化学制备过程中需要用到多种有毒有害试剂(如：TMSCl、吡啶、DCC等)，所以生产过程中安全系数低，环境兼容性低，再加上整体收率并不高，所以最终生产成本高。

随着大众对工业生产中的个人安全、自然环境保护的重视，绿色化学工业是其发展的必然趋势。作为生物催化的一部分，酶催化同时兼容了化学催化浓度高以及发酵生产的环保、条件温和等特点，现正逐渐成为绿色化学发展的重要方向。而酶法制备嘌呤霉素鲜有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种酶法制备嘌呤霉素的方法。该方法通过利用三步酶反应就能实现氨基核糖到嘌呤霉素的高效转化，因此在生产成本、环境保护、废气废水排放等各个方面都具有突出的优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种酶法制备嘌呤霉素的方法，包括如下步骤：

3-氨基-D-核糖在甲基硫核糖激酶与ATP作用下，生成β-氨基核糖-1-磷酸；

β-氨基核糖-1-磷酸和N,N-二甲基嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶作用下，生成3-氨基-N,N-二甲基腺苷；

3-氨基-N,N-二甲基腺苷和甲基酪氨酸在氨基酸连接酶与ATP作用下，生成嘌呤霉素。

本发明利用甲基硫核糖激酶(Kinase,EC 2.7.1.100)能磷酸化3-氨基-D-核糖得到相应的β-氨基核糖-1-磷酸，随后再嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，EC 2.4.2.1)作用下与N,N-二甲基嘌呤作用下转化成3-氨基-N,N-二甲基腺苷，最后在氨基酸连接酶的作用下(aaLigase，EC 6.3.2.28)与甲基化的酪氨酸缩合得到最终的嘌呤霉素。

在本发明中，嘌呤核苷磷酸化酶为PNP-a和/或PNP-b。