[发明专利]一种测定血浆中达格列净浓度的方法

说明书

本发明提供了一种测定血浆中达格列净浓度的方法，包括如下步骤血浆样品预处理、将预处理后的血浆样品进行液相色谱分离、质谱测定、计算等步骤：本发明方法与现有技术相比，具有如下优势：(1)达格列净加乙酸根离子形成带电负离子，才更容易在离子源处达到Rayleigh(雷利)极限进而库伦爆炸，提高灵敏度。(2)预处理方法简便。(3)专属性强。(4)灵敏度高：血浆最低定量限为1.0ng·mL^‑1。(5)无基质效应。(6)本发明方法快速、操作简便、准确、灵敏度高、检测限低。为达格列净的临床血药物浓度测定提供依据，服务于新药研究开发及临床应用。本方法的血浆标准曲线线性范围为1.0～4000ng·mL^‑1，批内和批间精密度RSD均小于15％。

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定血浆中达格列净浓度的方法。

背景技术

钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)表达于近端肾小管中，是负责肾小管滤过的葡萄糖重吸收的主要转运体。达格列净是一种SGLT2抑制剂，通过抑制SGLT2，减少滤过葡萄糖的重吸收，降低葡萄糖的肾阈值，从而增加尿糖排泄。临床上主要用于2型糖尿病成人患者改善血糖控制。

药物药代动力学以及生物等效性的研究均通过测定药物的药动学参数来评价，药物的检测分析显得非常重要。达格列净生物样品的成分复杂、基体干扰大，同时样品较难获得而且量少，被分析物的浓度通常很低，因此对生物样品分离分析技术提出的要求越来越高，亟需建立一种高灵敏度、高选择性的达格列净血浆浓度分析方法。LC-MS/MS法由于具有特异性好和灵敏度高等诸多优点，是小分子药物生物分析的首选方法。该技术主要步骤包括样品前处理、色谱分离以及质谱检测。

目前，国外现有技术中，前处理通常使用固相萃取法及液-液提取法，步骤较为复杂、成本高、耗时长。临床研究中通常需要检测大量的血液样本。复杂的前处理方法降低了检测的效率。另外，现有技术还存在血浆用量大、检测时间长、检测精度低等缺点。

国内关于人体口服达格列净片或缓释片后血浆中达格列净浓度分析方法没有文献报道。达格列净人体药动学研究中，达格列净在人体半衰期为12.9小时左右，给药后采集血液，至少采集至48小时或更长72小时，这对于分析方法的最低定量限要求很高。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种测定血浆中达格列净浓度的方法。本发明采用地西泮作为内标物，建立人血浆中达格列净的LC-MS/MS测定方法，并按照国家药品监督管理局的相关指导原则的要求对该方法进行验证，从而准确定量检测人血浆样品中的达格列净浓度。通过该方法对达格列净在人体内的药物代谢情况进行探索性研究，以期服务于新药开发(包括一致性评价)。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

包括如下步骤：

(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标地西泮溶液，加入乙腈沉淀蛋白，高速离心，吸取上清液，加入去离子水，混匀后进样；

(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：

色谱柱为AgilentZORBAXEclipse C8，4.6×100mm，3.5μm；

流动相：6mmoL/L醋酸铵水溶液和乙腈，两者体积比为50：50；柱温为35℃；流速为700μL·min^-1；进样量：50μL；

(3)质谱测定：