[发明专利]一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法

权利要求书

1.一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1外源基因设计：外源基因为“KOZAK序列-乙型脑炎病毒信号肽-乙型肝炎病毒表面核心抗原-SS-SS-Th表位-Linker连接序列-斜带石斑鱼mstn成熟肽基因序列”，将其合成并克隆至T载；

S2酶切：采用TAKARA Nhe I和Xho I酶在37℃分别对S1中的重组质粒和pcDNA3.1+载体进行双酶切，然后使用DNA片段纯化试剂盒进行片段回收；

S3连接反应：通过T4 DNA连接酶连接将S2中的载体片段和外源基因片段，反应体系在16℃下连接8h；

S4转化：将JM109感受态细胞从-80℃超低温冰箱中取出，置于冰上溶解后，将S3中的接连产物加入，然后加入不含抗性的LB液体培养基，然后生化箱中培养，再进行PCR验证，获得阳性菌种；

S5质粒的大量培养及纯化：将S5中获得的阳性菌种在含有相应抗性的LB液体培养基中培养，然后在溶菌酶的作用下获得质粒溶液，质粒溶液加入纯化仪，得到纯化的质粒溶液；

S6质粒浓缩：S5中获得的质粒浓度为500ng/μL，对质粒进行浓缩后，将浓度分别调整为500ng/μL、1000ng/μL、2000ng/μL后于-80℃保存，获得mstn自体核酸疫苗。

2.根据权利要求1所述的基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法，其特征在于，外源基因的重组质粒和载体双酶切体系包括：1.0μL Nhe I，1.0μL Xho I，≤2.0μg基因/质粒，2.0μL 10×buffer，不超过20.0μL ddH₂0，20.0μL Total Volume。

3.根据权利要求1所述的基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法，其特征在于，S2中使用DNA片段纯化试剂盒进行片段回收的方法包括以下步骤：

S201向PCR反应液中加入3倍体积的Buffer DC，然后均匀混合；

S202将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；

S203将S201的溶液转移至Spin Column中，12000rpm、室温的状态下离心1min，弃滤液；

S204将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，12000rpm、室温的状态下离心30s，弃滤液；

S205重复操作步骤S204；

S206将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm、室温的状态下离心1min；

S207取新的1.5mL的离心管并将Spin Column安置于上，在Spin Column膜的中央处加入30μL左右的Elution Buffer，室温静置1min；

S208 12000rpm、室温的状态下离心1min洗脱DNA。

4.根据权利要求1所述的基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法，其特征在于，S3中接连反应的反应体系如下：6.0μL外源基因片段，6.0μL载体片段，1.0μLT4 DNA连接酶，1.0μL10×T4 DNA Ligation Buffer，10.0μL Total Volume。