[发明专利]一种产D-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种产D‑塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中，利用基因工程的手段，在E.coli BL21的基础上构建了联合表达L‑阿拉伯糖异构酶(L‑AI)和β‑半乳糖苷酶(β‑gal)的基因工程菌，并将该基因工程菌用于转化乳清粉制备D‑塔格糖，D‑塔格糖的产量达到70～120g/L。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种产D-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

D-塔格糖是一种天然己酮糖，分子式为C₆H₁₀O₆，其是一种低热量甜味益生元，具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、抗龋齿、治疗贫血等功效。2001年，美国FDA批准其为普遍公认安全食品(GRAS)，因此可代替蔗糖广泛应用于果汁、饮料、口香糖等食品领域，同时还被广泛应用于医药行业。

目前，D-塔格糖的生产主要有化学法和生物法两种，其中化学法存在着能耗高、副产物多、纯化烦琐和污染大等缺点，不利于工业化生产。与化学法相比，生物法合成D-塔格糖具有环境友好、特异性高、副产物少、条件温和等优势，是未来D-塔格糖工业化生产的必然趋势。生物法通常以D-半乳糖为底物，利用L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase，L-AI)将其异构化为D-塔格糖，但由于D-半乳糖作为底物不够廉价且转化率不足等局限性。

近年来，研究者们逐渐将目光转向以更加廉价易得的工农业副产物乳清粉或商业化乳糖为底物制备D-塔格糖，即利用β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)水解乳糖生成D-葡萄糖和D-半乳糖后，生成的D-半乳糖再经L-AI制备D-塔格糖。目前关于乳清粉或乳糖制备D-塔格糖已有少量研究，但目前的研究报道中存在着利用昂贵的商业化β-半乳糖苷酶、关键酶来源不安全或性质不适宜、全细胞法存在细胞需求量大、异构化热力学平衡引起的D-塔格糖产量不高等问题。因此，基于过表达来源安全的β-gal和L-AI构建的基因工程菌，探索如何有效降低生产成本并提高D-塔格糖的产量是实现由廉价底物乳清粉生产D-塔格糖的工业化的必经之路。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种产D-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明中，利用基因工程的手段，在E.coli BL21的基础上构建了联合表达L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)和β-半乳糖苷酶(β-gal)的基因工程菌，并将该基因工程菌用于转化乳清粉制备D-塔格糖。

本发明首先提供了一种用于生产D-塔格糖的基因工程菌，记为E.coli BL21/β-gal-L-AI，其通过在E.coli BL21上构建表达L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)和β-半乳糖苷酶(β-gal)而得到。

本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)工程菌的构建：

PCR扩增来源于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CY.6)中的L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)基因，使用无缝克隆技术克隆至表达载体pANY1中，得到重组质粒pANY1-araA，经过将重组质粒转化至E.coli DH5α、筛选阳性克隆、测序得到E.coli DH5α/L-AI，然后将E.coli DH5α/L-AI培养、抽提重组质粒，并将重组质粒转化至E.coli BL21感受态中，得到L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)工程菌，记为E.coli BL21/L-AI；

(2)β-半乳糖苷酶(β-gal)工程菌的构建：