[发明专利]一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法

说明书

本发明公开了一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，是将待转化的酿酒酵母先在含有羟基脲的培养基上进行预培养，然后再通过常规转化方法将两端带有rDNA同源序列的DNA片段转入酿酒酵母，最后在筛选培养基上筛选转化子实现。本发明方法利用rDNA拷贝动态平衡的特点，建立了一次转化过程即在rDNA上整合了18个拷贝目的基因的方法。该方法以rDNA为整合靶点，操作便捷，无需额外引入除了重组DNA片段之外的其他DNA；并且，由于其所依赖的特殊机制，理论上可以和现有其他各种高拷贝重组方法联用，实现目的基因更高拷贝的整合，为基因编辑又提供了一种方法和有力的工具。

技术领域

本发明涉及一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法。属于生物工程技术领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是广泛用于食品和工业生产的微生物，其具有鲁棒性强、代谢旺盛以及食品级安全等特性。通过代谢工程手段，将合适的基因引入酿酒酵母，可以获得相应的细胞工厂。目的基因的表达水平和其在细胞中的拷贝数成正相关，因此，需要开发在细胞中引入目的基因的多个拷贝的技术。

在酿酒酵母中实现高拷贝表达基因，最有力的工具是2μ质粒载体。但是维持质粒的存在需要特定培养条件，例如营养缺陷型或者带有抗生素的培养基。相对于依赖于质粒载体的多拷贝表达，在基因组的重复序列上多拷贝整合目的基因具有稳定性好，不需要特殊的营养缺陷型或者含抗生素培养基的特点。目前常用的多拷贝整合方法是以染色体中的重复序列为整合靶点，两个最常用的靶点是delta(δ)区和rDNA区(Choi and Kim,2018；Fang et al.,2017；Liu et al.,2013；Semkiv et al.,2016)。但是，即使在染色体上有很多拷贝的靶点DNA，一次转化能整合到染色体上的实际目的基因拷贝数也很低，提高筛选培养基中的抗生素浓度是一种方式，但是效果有限，利用抗G418能力减弱的KanXM4突变子作为筛选标记基因，能够在较温和的抗生素浓度下达到高浓度抗生素筛选的标准(Semkiv etal.,2016)。有工作利用CRISPR-Cas9技术在染色体上delta(δ)区(Shi et al.,2016)或者rDNA区(Wang et al.,2018)制造双链断裂位点，也提高了整合基因的拷贝数。这种方式在将目的基因引入前，需要在酵母中引入Cas9和gRNA。并且，由于rDNA的重要功能以及高度串联重复的特点，Cas9切割过度会直接导致细胞死亡，需要摸索合适的条件。

经检索，有关依据染色体上rDNA是多拷贝重复单元，并且rDNA拷贝数维持动态平衡的特点，先利用羟基脲(hydroxyurea)刺激细胞，使部分rDNA拷贝从染色体上丢失，之后将目的基因整合在剩余的rDNA拷贝上；当去除环境中的羟基脲后，rDNA区域按其拷贝数恢复机制出现不等姐妹染色单体重组；使整合在rDNA中的目的基因拷贝数随着rDNA拷贝数的增加而增加，实现将目的基因多拷贝整合到染色体rDNA的方法未见报道。

主要参考文献

Choi,H.J.,Kim,Y.H.,2018.Simultaneous and sequential integration byCre/loxP site-specific recombination in Saccharomyces cerevisiae.J MicrobiolBiotechnol.28,826-830.

Fang,C.,Wang,Q.,Selvaraj,J.N.,Zhou,Y.,Ma,L.,Zhang,G.,Ma,Y.,2017.Highcopy and stable expression of the xylanase XynHB in Saccharomyces cerevisiaeby rDNA-mediated integration.Sci Rep.7,8747.