[发明专利]一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法

说明书

本发明属于医药技术领域，具体涉及了一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法。本发明首先选择性地清除血清样品中的高丰度干扰蛋白（白蛋白和免疫球蛋白），然后进一步通过特异性标记结合亲和层析方法对血清中的疏亚硝基化蛋白进行富集。本发明特异性好，操作简单，避免了目前巯亚硝基化蛋白富集操作复杂、杂质影响大、富集效率低的问题。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法。

背景技术

蛋白质巯基亚硝基化（protein S-nitrosylation, SNO）是生物体内一种可逆的氧化还原修饰。通常认为，一氧化氮（Nitric Oxide, NO）修饰蛋白质特殊位置上的半胱氨酸巯基（-SH）生成带有巯亚硝基（-SNO）的产物。巯亚硝基化形成的过程仍在探索之中，目前有三种途径：（1）形成阳离子（nitrosoniumcation, NO⁺）与半胱氨酸巯基反应；（2）活性氧促进形成蛋白质硫自由基（RS·），RS·与NO直接生成巯亚硝基蛋白；（3）转亚硝基化反应，即从相邻巯基亚硝基化蛋白质中获得-SNO。已有研究表明，蛋白质巯基亚硝基化影响蛋白质活性，进而调控细胞功能，例如参与细胞凋亡，调控离子通道，影响酶活性，调节膜受体功能。进一步地，蛋白质巯亚硝基化与疾病的关系也备受关注，研究巯亚硝基化有助于为癌症防治提供新的思路。

目前使用范围最广的检测蛋白质巯亚硝基化的方法是生物素转化法（BiotinSwitch assay，BSA），主要步骤是：首先利用烷基化试剂封闭蛋白质混合物中的巯基（-SH），然后利用还原性物质，如抗坏血酸盐，将巯亚硝基化蛋白质上的-SNO 还原为-SH，最后利用生物素标记试剂Biotin-HPDP标记被还原半胱氨酸上的-SH。该方法使发生巯亚硝基化的蛋白质都被生物素标记，再使用相应的抗体，利用亲和层析的方法纯化富集目的蛋白质，最后利用蛋白免疫印迹试验（Western Blot，WB)检测生物标记即可检测巯亚硝基化修饰的蛋白质。但是血清样品中成分复杂，在WB过程中可能产生假阳性信号，而本实验中的巯亚硝基化检测，使用非生物素化的iodo-TMT试剂代替Biotin-HPDP，从而在WB中减少了背景。

血清是指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体。血清蛋白质组包含多种疾病生物标志物。一般而言，血清是反映生物体生理状态的体液，因此常用于疾病过程的生物标志物研究。由于血清的稳定作用和维持生物体的稳态，所观察到的成分变化相当小。在筛查试验、临床前阶段的早期疾病检测、微转移检测或“非手术”癌症的诊断中，血液蛋白质组分析是必不可少的诊断方法。然而，其组分的复杂性和巨大的动态范围，加上降解和翻译后修饰的多种机制，以及脂质、盐和其他代谢物的存在而进一步复杂化，这对分析灵敏度、分辨率和重现性构成了真正的挑战。最典型的是血清中关于低丰度蛋白的研究，其检测通常受到白蛋白、免疫球蛋白和其他高丰度血清蛋白的影响。据研究，不同类型血清蛋白在总蛋白中的浓度依次为：白蛋白约占60%，球蛋白约占35%，其余为脂蛋白、铁结合/转移蛋白和生长因子等。因此，分析血清样品中的蛋白质通常需要分离它们的成分，因为白蛋白的存在会阻碍其他蛋白质的鉴定，不仅在基于质谱的研究方法中，而且在二维电泳和蛋白免疫印迹实验中也是如此。

目前，没有关于从血清中富集巯亚硝基化蛋白的方法说明，尤其是缺少在富集前清除干扰蛋白，从而提高富集特异性的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，其采用磷酸钠-氯化钠缓冲液、ProteinA琼脂糖、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ、丙酮、HENS缓冲液、MMTS、iodo TMT标志试剂、抗坏血酸、Anti-TMT树脂、TBS缓冲液Ⅰ、TBS缓冲液Ⅱ、双蒸水、TMT洗脱缓冲液实现对血清中巯亚硝基化蛋白的富集。

上述的血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，包括以下步骤：