[发明专利]一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法

权利要求书

1.一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，其特征在于：其采用磷酸钠-氯化钠缓冲液、Protein A琼脂糖、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ、丙酮、HENS缓冲液、MMTS、iodo TMT标志试剂、抗坏血酸、Anti-TMT树脂、TBS缓冲液Ⅰ、TBS缓冲液Ⅱ、双蒸水、TMT洗脱缓冲液实现对血清中巯亚硝基化蛋白的富集。

2.根据权利要求1所述的血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，免疫球蛋白和白蛋白的去除，具体如下：

①取人血清，离心得第一上清液；

②将115μL第一上清液和230μL磷酸钠-氯化钠缓冲液充分混合，加入至经 200μLProtein A琼脂糖和600μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ清洗后的离心柱中，置于4℃摇床上1-2h，离心得第一滤液和第一沉淀；

③向装有第一沉淀的离心柱中加入2200μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ，离心得第二滤液和第二沉淀；

④合并第一滤液和第二滤液，预冷10min后取500μL混合滤液，向其中加入362μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h，离心得第三沉淀，用400-600μL HENS缓冲液重悬第三沉淀，并调节其浓度为1mg/mL，即得到除去免疫球蛋白和白蛋白的血清蛋白悬液；

步骤二，巯亚硝基化蛋白的特异性标记，具体如下：

①取100μL步骤一得到的血清蛋白悬液，向其中加入2μLMMTS，涡旋震荡1min，避光孵育30min，再加入500μL预冷的丙酮，-20℃静置1h，离心去除丙酮，得第四沉淀；

②用100μLHENS缓冲液重悬第四沉淀，向其中加入2μL iodo TMT标志试剂，涡旋混匀，再加入4μL抗坏血酸，涡旋混匀，避光孵育2h，然后加入500μL预冷的丙酮，-20℃静置1h，离心去除丙酮，得第五沉淀；

③用400-600μL HENS缓冲液重悬第五沉淀，调节其浓度为1mg/mL，即得到特异性标记的巯亚硝基化蛋白的悬液；

步骤三，巯亚硝基化蛋白的洗脱，具体如下：

①以50μL TBS缓冲液Ⅰ清洗装有200μL Anti-TMT树脂的纯化柱，离心得第六沉淀；

②向装有第六沉淀的纯化柱中中加入100μL步骤二得到的巯亚硝基化蛋白悬液，避光孵育2h，离心得第七沉淀；

③向装有第七沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅱ以清洗Anti-TMT树脂，离心得第八沉淀；

④向装有第八沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ以清洗Anti-TMT树脂，离心得第九沉淀；

⑤向装有第九沉淀的纯化柱中加入200μL双蒸水洗树脂以清洗Anti-TMT树脂，离心得第十沉淀；

⑥向装有第十沉淀的纯化柱中加入200μL TMT洗脱缓冲液以洗脱巯亚硝基化蛋白，离心得到的滤液即为从血清中富集的巯亚硝基化蛋白的溶液。

3.根据权利要求2所述的血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，其特征在于：

所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ：将50mL 0.2M甘氨酸与3.2mL 0.2M盐酸混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH =5；

所述磷酸钠-氯化钠缓冲液：将2.2g Na₂HPO₄、0.3g NaH₂PO4、5.5g NaCl溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH =7.2；

所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ：将50mL 0.2M甘氨酸与7.3mL 0.2M盐酸混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH=3.3；

所述HENS缓冲液：将59.58g Hepes、0.37g EDTA、0.03g新亚铜试剂溶解于1000ml双蒸水中；将混合液与质量分数为1%的SDS按1:25的体积比混合；调节pH=7.7；

所述TBS缓冲液Ⅰ：将8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris base溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH=7.4；

所述TBS缓冲液Ⅱ：将0.12g尿素溶解于1mL TBS缓冲液Ⅰ中；调节pH=7.4；

所述TMT洗脱缓冲液：将0.95g Hepes、1.17g NaOH、0.07g EDTA、1.56g 2-ME溶解于双蒸水并定容至200mL；调节pH=7.7。