[发明专利]一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法

权利要求书

1.一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.胁迫处理

裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，对离体叶片浸泡6～48h，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞释放大量的活性氧(ROS)，在酶的催化下，活性氧与荧光素反应形成具有荧光的化合物；

S2.显微镜观察

将试管内的离体叶片取出并依次放在荧光显微镜下观察离体叶片中的荧光强度和分布特征，就能区分水稻叶肉细胞的镉敏感性在基因型间的差异，叶片中的荧光斑点越多、荧光面积越大，表明叶肉细胞释放的ROS越多、对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶肉细胞的耐镉能力越强。

2.根据权利要求1所述的一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，其特征在于：所述鉴定水稻镉敏感性的方法，还有另外一种方式，包括以下步骤：

S1.胁迫处理

裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞的过氧化氢分布特征在基因型间表现出明显的差异，把离体叶片放在不同浓度的镉溶液中处理12～48h，然后取出浸泡在含有还原型二氯荧光素(DCF)的反应罐中孵育1～10h，DCF中无荧光的乙酸酯基团被叶片中的过氧化氢氧化，生成带电荷的二氯荧光素后对离体叶片进行染色处理；

S2.显微镜观察

将反应罐内的离体叶片放在荧光显微镜下观察离体叶片中的荧光强度和分布特征，就能快速准确地判断基因型的耐镉能力，叶片中绿色荧光斑点越多，说明镉胁迫环境叶片产生的过氧化氢越多、叶肉细胞对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶片中绿色荧光斑点越少，叶肉细胞的耐镉能力越强。

3.根据权利要求1所述的一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，其特征在于：所述鉴定水稻镉敏感性的方法，还有另外一种方式，包括以下步骤：

S1.胁迫处理

裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞的O2·-分布特征在基因型间表现出明显的差异，把离体叶片放在不同浓度的镉溶液中处理6～48h，然后取出浸泡在含有氮蓝四唑(NBT)的反应罐中孵育1～10h，氮蓝四唑被还原为蓝色的甲腙，在560nm处有最大吸收峰，然后对离体叶片进行染色处理；

S2.显微镜观察

将反应罐内的离体叶片放在荧光显微镜下观察离体叶片中的光斑大小和分布特征，就能快速准确地判断基因型的耐镉能力，叶片中蓝色斑点越多，说明镉胁迫环境叶片产生的O2·-越多、叶肉细胞对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶片中蓝色荧光斑点越少，叶肉细胞的耐镉能力越强。

4.根据权利要求1-3所述的一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，其特征在于：所述不同水稻基因型的离体叶片的裁剪长度为3cm。

5.根据权利要求1-3所述的一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，其特征在于：所述镉溶液为氯化镉溶液，其中镉浓度为0.9，4.5，9.0，13.5，18.0μmol·L^-1中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，其特征在于：所述染色处理的详细操作为选择活性氧ROS分析试剂盒二氯二氢荧光素二乙酸酯，对离体叶片进行染色处理，孵育时间1～10h。

7.根据权利要求3所述的一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，其特征在于：所述染色处理的详细操作为选择氮蓝四唑(NBT)染色试剂盒，对离体叶片进行染色处理，孵育时间1～10h。