[发明专利]一种基于通用探针检测牛奶中雌二醇的方法

说明书

本发明公开了一种基于通用探针检测牛奶中雌二醇的方法，属于荧光定量免疫分析快速检测技术领域。本发明基于量子点荧光微球(QBs)、重组蛋白A(SPA)、兔抗鼠IgG二抗(anti‑IgG)构建了两种通用探针QBs@SPA和QBs@SPA@anti‑IgG；之后基于所制备的通用探针、抗雌二醇的单克隆抗体、试纸条T线抗原、C线二抗，制备了免疫层析检测体系，其中游离雌二醇单抗和通用探针分别作为识别元件和信号供体，最大限度地释放了抗体的Fab区，提高了检测灵敏度，为牛奶中雌激素的定量分析提供了一种快速灵敏稳定有效的即时检测方法。

技术领域

本发明涉及一种基于通用探针检测牛奶中雌二醇的方法，属于荧光定量免疫分析快速检测技术领域。

背景技术

雌激素对环境和食物造成的污染越来越受到重视。随着外源性雌激素的摄入，会导致人体内分泌合成代谢失衡，从而引起人体疾病。雌二醇(E2)是一种常见于环境水、乳制品和肉类中的典型雌激素污染物。常用的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用等仪器分析方法；和酶联免疫分析、免疫传感器等基于抗体识别的免疫学检测方法。其中免疫层析检测技术反应快速、简单经济，是现场即时检测的理想方法。免疫层析检测技术不仅具有均相免疫测定的快速性，还具有非均相方法的可以分离反应和未反应化合物的优势，已广泛应用于真菌毒素、农药残留、食物过敏原、食源性病原体检测等领域。

目前检测雌二醇的试纸条虽有报道，如中国专利CN107656075A基于时间分辨荧光微球的免疫层析试纸条，CN208060533U基于胶体金的雌二醇检测试纸条，CN106366320B基于雌二醇分子印迹聚合物的试纸条，CN105572393A基于雌二醇核酸适配体的试纸条，但是仍然缺少基于量子点荧光微球定量检测牛奶中雌二醇的试纸条。而且这些试纸条的探针制备时，抗体是随机固定的，抗体和标记物定向偶联的效率常常被忽略，这就导致了抗体Fab区没有充分暴露以获得更多接触目标物的机会。

此外，与固定在纳米颗粒标记物表面的抗体相比，游离抗体有更多机会结合样品溶液中的靶标。因为游离抗体具有更好的生物活性和更快的布朗运动。所以，与IgG抗体Fc区的特异性识别是充分暴露抗原结合Fab片段并保护其生物活性的有效策略，靶向IgG抗体Fc区的蛋白A可以作为纳米材料标记物和抗体之间的桥梁。

发明内容

[技术问题]

目前在制备大多数探针时，抗体是随机固定的，抗体和标记物定向偶联的效率常常被忽略，导致了抗体Fab区没有充分暴露以获得更多接触目标物的机会。而且，检测雌二醇的试纸条虽有报道，但是仍然缺少基于量子点荧光微球定量检测牛奶中雌二醇的试纸条。

[技术方案]

为了解决上述至少一个问题，本发明基于量子点荧光微球(QBs)、重组蛋白A(SPA)、兔抗鼠IgG二抗(anti-IgG)构建了两种通用探针QBs@SPA和QBs@SPA@anti-IgG；之后基于所制备的通用探针、抗雌二醇的单克隆抗体、试纸条T线抗原、C线二抗，制备了免疫层析检测体系，其中游离雌二醇单抗和通用探针分别作为识别元件和信号供体，最大限度地释放了抗体的Fab区，提高了检测灵敏度，为牛奶中雌激素的定量分析提供了一种快速灵敏稳定有效的即时检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种制备通用探针QBs@SPA的方法，包括如下步骤：

(1)将QBs分散于PB(磷酸)缓冲液中，混合均匀；之后加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化剂孵育震荡；再加入SPA(重组金黄色葡萄球菌蛋白A)，继续孵育震荡，得到混合物；

(2)将BSA(牛血清白蛋白)溶液加入步骤(1)的混合物中进行封闭，得到封闭后的混合物；

(3)将封闭后的混合物离心，得到通用探针QBs@SPA。