[发明专利]具备较强抗凝血活性的医蛭基因突变水蛭素及其制备方法

说明书

在分子动力学（MD）蛋白质结合力分析、分子生物学以及药理学筛选基础上，本专利制备了医蛭（Hirudo medicinalis）基因突变水蛭素（HV1）HV1‑E62D‑Y63D‑L64D以及HV1‑E62D‑L64D。药效分析实验表明，HV1‑E62D‑Y63D‑L64D以及HV1‑E62D‑L64D具备优于野生型基因重组HV1的抗凝血活性。本发明专利说明书详细介绍了以上医蛭基因突变水蛭素HV1‑E62D‑Y63D‑L64D以及HV1‑E62D‑L64D以及它们的制备方法和药理学作用。

技术领域

本发明属于蛋白质工程制药领域，具体涉及一组一级结构改造的医蛭基因重组水蛭素，及其制备和分离纯化方法。

背景技术

天然水蛭素是从吸血水蛭的唾液腺中提取的一种单链多肽，是目前已知的最有效的凝血酶抑制剂，其中HV1是由医蛭(Hirudo medicinalis)分泌。 HV1由65个氨基酸残基组成，相对分子质量为7.8kD，C末端富含酸性氨基酸，包括第63位可以发生硫酸化修饰的酪氨酸。在凝血途经中，水蛭素以凝血级联反应中的核心酶--凝血酶作为靶标，通过离子键和疏水作用力与凝血酶紧密且不可逆转地结合，使其失去裂解可溶性纤维蛋白原的能力，从而阻止不溶性纤维蛋白的形成。多种动物模型和临床药理研究表明，水蛭素能有效防治血栓性疾病，尤其是凝血酶起关键作用的疾病。同时，水蛭素具有不需要任何内源性辅助因子(如抗凝血酶(AT))，出血少，免疫原性低等优点。

目前，天然水蛭素只能以很低的产量分离出来，且药用水蛭的数量有限，无法制备足够的水蛭素用于治疗目的。近年来，也有研究者利用微生物表达基因重组水蛭素，但是与天然水蛭素相比，微生物表达的水蛭素C末端缺乏酪氨酸O-硫酸化修饰，缺少与“外部位点I”相互作用的带有负电荷的基团，因此抗凝血活性低于野生型水蛭素。为了解决这一问题，我们利用基因工程技术将C 末端的多个氨基酸残基突变为天冬氨基酸，以增加水蛭素C末端所带的负电荷，获得较高抗凝血活性的基因重组药用水蛭水蛭素。

发明内容

1.发明的目的

利用大肠杆菌工程菌种表达并纯化具有较强抗凝血活性的医蛭基因重组水蛭素突变体，及其制备方法。

2.发明的技术方案

一、提高抗凝血活性的重组水蛭素HV1突变体的设计

利用GROMACS分子动力学(MD)分析系统的WHAM模块，我们分析了野生型以及多种突变型HV1的C末端与凝血酶的结合力。分析结果表明，通过氨基酸残基突变为天冬氨酸(Asp或D)增加C末端的负电荷(图1)，可以提高水蛭素与凝血酶的亲和力(图2)。MD分析可以提供一定的理论依据，实际作用需要通过实验来验证。在MD分析基础上，我们设计了多种用于提高水蛭素HV1抗凝血活性的突变体，并进行筛选，本专利设计所描述的是其中的的HV1的突变体HV1-E62D-L64D和HV1-E62D-Y63D-L64D(图3)。

二、基因重组水蛭素HV1及其突变体的表达质粒构建

模板的准备：从NCBI获得HV1的CDS序列。根据原核表达系统中密码子的偏好性，进行碱基序列优化(核苷酸或氨基酸序列表中第2条序列)，并合成。

序列的准备：设计PCR引物，利用上游引物引入His亲和纯化标签，利用下游引物序列引入氨基酸突变位点的碱基序列。