[发明专利]一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液，生物素化标记GP73抗体溶液、碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液、校准品、洗液和底物溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化标记GP73抗体溶液的制备方法包括以下步骤：

1)量取GP73抗体和生物素-NHS备用；

2)将生物素-NHS用DMSO进行溶解后，加入GP73抗体充分混匀；

3)将步骤2)的反应产物透析，得混合物，并用抗试剂缓冲液稀释得生物素化标记GP73抗体溶液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述GP73抗体为单克隆抗体；所述GP73抗体和生物素-NHS的摩尔比为0.8～1.2：20；所述生物素-NHS用DMSO溶解后的终浓度为5mg/ml；所述反应的时间为2h；所述透析的透析袋规格为分子量500；透析缓冲液为PH＝7.5的0.15M PBS缓冲液，所述抗试剂缓冲液为0.15M pH 7.3磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，0.1％ProClin300；所述稀释的程度至所述混合物为0.5μg/ml。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液的制备方法包括以下步骤：

1)将高尔基体蛋白73抗体用0.1M PBS进行透析，用2-亚氨基硫烷盐酸盐，活化；

2)将碱性磷酸酶用(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯活化；

3)将活化后的高尔基体蛋白73抗体和碱性磷酸酶进行混合，2～8℃反应15～20h，得反应物；

4)将反应物纯化，得碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体；

5)用抗试剂缓冲液将所述碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体稀释，得碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤1)所述高尔基体蛋白73抗体和所述2-亚氨基硫烷盐酸盐质量比为20:7，室温活化25～30min；步骤2)所述碱性磷酸酶和(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的质量比为2:1，室温活化25～30min；步骤3)所述活化后的高尔基体蛋白73抗体和碱性磷酸酶的质量比为1:1；步骤4)所述纯化条件为用superdex 200层析柱，在0.15M磷酸盐缓冲液下2mL/S，20～30min后收集Ⅰ峰，30～40min后收集Ⅱ峰，将Ⅰ峰和Ⅱ峰进行混合后，测试波长280的OD值；步骤5)所述抗试剂缓冲液包括0.15M pH 7.3磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，0.1％ProClin 300；所述稀释至所述碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体浓度0.1μg/ml。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品的制备方法包括以下步骤：

1)配制校准品缓冲液：0.05M的pH7.4的TRIS缓冲液中加入0.5％的牛血清白蛋白，0.2％防腐剂；

2)将GP73纯品用校准品缓冲液进行稀释，校准品浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、150ng/mL、300ng/mL和500ng/mL的高尔基体蛋白73溶液。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗液的制备方法包括以下步骤：

1)纯化水700mL，搅拌条件下依次加入氯化钠20g、磷酸二氢钾2g、十二水磷酸氢二钠29g、氯化钾2g、叠氮钠2g、吐温20 5mL充分搅拌直至完全溶解，调节pH值至8.6±0.05；

2)用纯化水定重至1000g，室温搅拌混匀，经0.22μm滤膜过滤，即得洗液。

8.一种非诊断治疗目的利用磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取样本30μl、生物素标记GP73抗体溶液30μl、碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液30μl，37℃孵育15min；

2)加入链霉亲和素磁珠30μl，孵育5min；

3)磁分离2min，去上清，洗涤3次，每次300μl洗液；

4)加入底物溶液200μl，检测波长在400～600nm之间的发光值。