[发明专利]一种提高Treg细胞活性的外泌体的培养方法

说明书

本发明提供一种提高Treg细胞活性的外泌体的培养方法，在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加干细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝素钠、前列腺素E2、TGF‑b和维生素C，对所获得的培养液上清进行超速离心，获取可提高Treg细胞活性的外泌体。干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子提高细胞的干性，维生素C的添加主要起到抗氧化作用，减少细胞传代过程中复制性衰老，抗凝剂的添加主要是为了减少细胞的粘连，其他成纤维细胞生长因子、TGF‑b、前列腺素E2、不饱和脂肪酸的添加主要是可增强间充质干细胞分泌的外泌体激活Treg细胞活性的能力，有效提高外泌体的应用范围及效果。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高Treg细胞活性的外泌体的培养方法。

背景技术

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

申请号为CN201810168252.3的专利《人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用》提供了人脐带间充质干细胞外泌体的蔗糖密度梯度离心分离纯化方法，以及人脐带间充质干细胞外泌体应用到II型糖尿病模型的治疗，该外泌体来自培养液的简单培养，没有提及外泌体其他的功能方面的改进。因此，现有的技术大多集中于外泌体分离方法的改进及优化，对于外泌体本身的功能改进还需要进一步的探索。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了提高Treg细胞活性的外泌体的培养方法。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种提高Treg细胞活性的外泌体的培养方法，在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加生长因子、TGF-b、维生素C、抗凝剂和不饱和脂肪酸，培养获得的细胞上清超速离心后得到提高Treg细胞活性的外泌体。

优选地，所述基础培养液为含有10%胎牛血清的aMEM培养液。

优选地，所述生长因子选自干细胞生长因子或成纤维细胞生长因子中的至少一种。

优选地，所述抗凝剂选自肝素钠；所述不饱和脂肪酸选自前列腺素E2。

优选地，在基础培养液中添加生长因子、TGF-b、维生素C、抗凝剂和不饱和脂肪酸的方式如下：

（1）在P1-P3代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加干细胞生长因子及成纤维细胞生长因子；

（2）在P4，P5 代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加成纤维细胞生长因子、TGF-b、维生素C、前列腺素E2、抗凝剂和不饱和脂肪酸。

步骤（1）中干细胞因子和成纤维生长因子的添加主要是提高P1-P3代细胞的干性，增强细胞的增殖能力，步骤（2）中培养液中添加成纤维细胞生长因子、TGF-b、维生素C、抗凝剂和不饱和脂肪酸，其中维生素C的添加主要起到抗氧化作用，减少细胞传代过程中复制性衰老，抗凝剂的添加主要是为了减少细胞的粘连，其他成纤维细胞生长因子、TGF-b、前列腺素E2、不饱和脂肪酸的添加主要是可增强间充质干细胞分泌的外泌体激活Treg细胞活性的能力。

优选地，步骤（1）中干细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的浓度均为1-30ng/mL。例如1ng/mL、3ng/mL、7ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、22ng/mL、27ng/mL、或30ng/mL。