[发明专利]去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法

说明书

本发明涉及医药材料领域，特别涉及去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法。本发明采用洗涤剂和酶结合的方法，充分利用新型洗涤剂的破膜和去污能力，同时利用核酶的特异性分解作用，有效去除细胞成分。达到时间短，脱细胞性效果好的优势。

技术领域

本发明涉及医药材料领域，特别涉及去除同种或异种生物材料的细胞成分和/或核酸物质的方法。

背景技术

心脏瓣膜疾病是一种具有高发病率及高致死率的疾病，全世界范围内心脏瓣膜疾病率随着老年化的日益加重，正逐年攀升，已成为世界范围内危及生命的主要医疗保健问题之一。晚期瓣膜性疾病导致丧失自我修复功能，瓣膜置换术成为唯一的手术选择。全世界每年进行近30万例瓣膜置换手术，预计到2050年这个数字将增加两倍。目前人造心脏瓣膜主要由机械心脏瓣膜和生物假体心脏瓣膜两大类型组成，并已广泛应用了几十年。两种人造瓣膜各有优缺点；机械瓣膜耐久高，可以达到二十年以上，但是其容易形成血栓，需要终生抗凝。而生物心脏瓣膜由于其较机械瓣膜有更低的血栓形成性，从而避免了终生抗凝的需要，并且能表现出与天然瓣膜相似的优良的血流动力学特性而越来越多地被临床采用，但是生物心脏的耐久性较差，使用寿命只有10-15年，导致患者需承受再次开胸手术的痛苦。

生物人工心脏瓣膜主要来源于牛心包或猪心脏瓣膜，具有较好的血流动力学特性，无需抗凝治疗。然而由于生物瓣膜材料属于异种组织材料，不可避免的会有免疫原性，从而发生排斥反应。来自异种组织的细胞往往被机体视为外来物，从而发生免疫排斥反应攻击外来细胞，导致细胞的失活和死亡，从而导致组织瓣膜的钙化和衰败。为了防止生物瓣膜的钙化和衰败，脱细胞化已被提出作为一种降低组织抗原性的方法，从而获得更好的组织相容性、重塑和长期持久性。

目前生物瓣膜材料的脱细胞方案，主要包括物理方法(如通过低渗和高渗反复交替、反复冻融、冷冻干燥、超高压等)、化学方法(高浓度的离子、非离子、两性离子洗涤剂(Triton X-100(曲那通X-100)，十二烷基硫酸钠(SDS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPs)等)和酶的方法(胰蛋白酶和核酸酶(DNAse和RNAse)等)脱去细胞。

单一的脱细胞方案会因为强度或试剂浓度过高导致对生物瓣膜材料的力学性能破坏较大，而过低的强度或试剂浓度又会导致脱细胞不够彻底，免疫成分残留的问题。例如物理方式的处理是通过破坏细胞质材料来裂解细胞，它们往往不足以除去所有的细胞成分和免疫原性内容物，而且处理时间长，单次处理需要6到9天的时间；许多化学方法都已用于脱细胞中，这些洗涤剂中的每一种都有其独特的方式来改变细胞的结构和成分以及细胞外基质的三维结构，对材料的力学性能有所影响，甚至引起部分纤维的断裂，暴露更多的抗原位点，而导致体内的急性免疫反应。酶是一种功能强大的脱细胞工具，由于它们的高特异性，可用于消化核酸(DNA和RNA)或去除不需要的ECM残基。胰蛋白酶和核酸酶一直用于脱细胞的工具。但胰酶对细胞外基质结构的损害较大，可破坏异种生物瓣膜材料的三维结构，使力学性能受损。

因此采用化学试剂和酶处理的复合手段才是最佳的脱细胞方法，可以降低物理作用的强度、降低化学试剂或酶的使用浓度，减轻对细胞外基质的损害，在充分去除细胞成分、降低免疫原性的同时，最大限度的维持细胞外基质成分，保证其生物力学性能。目前，国内外应用最多的联合方法一般是化学试剂+酶学的方法,常利用SDS或者Triton X-100结合核酶和胰酶处理。

虽然国内外有多种脱细胞的方法，但仍存在一些问题：(1)相应的化学试剂可引起细胞外基质三维结构的破坏，对脱细胞组织的力学性能有负面影响；(2)其相应的处理时间持续较长，特别是单一或者仅两者方法结合的，其处理过程均在一周以上。

因此，如何快速高效的去除牛心包的细胞成分，维持异种生物瓣膜完整的细胞外基质结构，并保证其良好的生物力学性能，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明采用新型的两性离子去污剂椰油酰胺丙基甜菜碱(CAB)及核酶结合的复合手段对生物瓣膜牛心包材料进行脱细胞。