[发明专利]一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用，属于动物基因工程技术领域，其中所述sgRNA的核苷酸序列如序列表SEQID NO.1‑2所示。本发明通过对sgRNA进行优选，构建相应载体，将其与包含cas9基因的载体一同转入PK‑15细胞中，经筛选得到了可同时稳定表达cas9基因和如SEQ ID NO.1‑2所示的sgRNA的阳性细胞即cas9‑B2PK15细胞株，经测定该细胞株对伪狂犬病毒的基因具有显著敲除能力，因此可显著耐受伪狂犬病毒感染，这对动物生产过程中抗伪狂犬病毒感染具有重要意义；并且基于该细胞株可制备得到抗伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型，在伪狂犬病毒的临床和实验室研究中具有广阔的应用价值。

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

抗病毒是医学与生物技术界一个永恒的研究课题，几乎所有的病毒的关键生命活动都只能在细胞(包括细菌、真菌等)内进行，因此，理论上抗病毒的主战场应该在细胞内，但由于细胞膜的特殊性，对病毒有杀灭作用的胞外大分子药物很难突破细胞膜进入细胞内，这些药物(包括机体免疫细胞所产生的抗体)只能守候在带毒细胞外，等病毒从这些被感染细胞中释放出来后才能针对病毒发挥作用，这也是到目前为止几乎所有的抗病毒药物无法在体内实际发挥治疗病毒病作用的主要原因，也是某些寄生于“长命”细胞中而且又不会立即导致细胞死亡的病毒无法用免疫的方法阻止其传播的主要原因。

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型，传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。由于本病的临床症状类似狂犬病，故用了“伪狂犬病”这一病名，该病毒是疱疹病毒中抵抗力较强的一种，其对乙醚、氯仿等脂溶剂、福尔马林和紫外线照射等敏感；在pH 4～9之间稳定；对热抵抗力较强，能在多种组织细胞内增殖。其中以兔肾和猪肾细胞(包括原代细胞或传代细胞等)最适于病毒的培养，目前用于防治该疾病的疫苗主要包括灭活疫苗和弱毒疫苗。

2008年，人们发现了CRISPR/Cas系统，该系统是一套细菌对侵入体内的病毒(噬菌体)的免疫机制，其作用机理是：细菌自身的CRISPRs和CRISPR相关基因cas一起组成了CRISPR/Cas免疫系统。当噬菌体侵入细菌体内后，这个免疫系统首先是将外源入侵DNA片段整合到CRISPR位点，紧接着CRISPR转录成为小RNA指引多功能蛋白复合物来识别以及切除外源基因。哺乳动物细胞内可能亦存在类似机制，但目前人们对此知之甚少，在此情况下，给哺乳动物细胞人为安装一套CRISPR/Cas系统，使其能够对侵入细胞内的病毒基因的关键序列进行特异性编辑，使病毒丧失扩增、感染或致病等生命活动能力，则有可能达到胞内抗病毒目的，这对动物生产和抗病将具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用，通过对特异性识别并敲除的sgRNA进行优选，使sgRNA与cas9基因在PK-15细胞株中稳定表达，得到一株对伪狂犬病毒关键基因具有显著敲除能力，进而有效耐受伪狂犬病毒感染的细胞株，基于该细胞株可制备得到抗伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型，在动物生产、临床和实验室研究中具有广阔的应用价值。

本发明的目的之一在于提供了一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1-2所示。

进一步地，所述关键基因为伪狂犬病毒的UL27基因。

本发明的目的之二在于提供了一种载体，所述载体中包含上述sgRNA。

进一步地，所述载体为AAV-ITR-U6-B2sgRNA。

本发明的目的之三在于提供了上述载体的构建方法，所述方法包括：

步骤1、酶切并回收获得线性化AVV-ITR-U6载体；