[发明专利]一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种用于构建表达编码胞内编辑伪狂犬病毒基因的sgRNA的载体的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO. 1-2所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体中包含如权利要求1所述用于构建表达编码胞内编辑伪狂犬病毒基因的sgRNA载体的寡核苷酸。

3.如权利要求2所述的载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1、酶切并回收获得线性化AVV-ITR-U6载体；

步骤2、将如序列表SEQ ID NO. 1-2所示的寡核苷酸进行变性退火，形成具有黏性末端的双链寡核苷酸；

步骤3、将步骤1得到的线性化AVV-ITR-U6载体与步骤2得到的双链寡核苷酸连接，转化至感受态细胞中，筛选阳性菌后提取质粒，经测序比对后得到载体AAV-ITR-U6-B2sgRNA。

4.如权利要求2所述的载体在制备胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株中的应用。

5.一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株中包括：cas9基因和如权利要求1所述用于构建表达编码胞内编辑伪狂犬病毒基因的sgRNA的载体的寡核苷酸。

6.根据权利要求5所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株为PK-15细胞株。

7.如权利要求5所述的胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

步骤S1、将包含cas9基因的载体转染至PK-15细胞中并筛选阳性细胞，获得稳定表达cas9基因的PK-15-Cas9细胞；

步骤S2、将如权利要求2所述的载体转染PK-15-Cas9细胞，筛选阳性细胞并进行单克隆培养，得到同时稳定表达cas9基因和包含如SEQ ID NO. 1-2所示的寡核苷酸的sgRNA的PK-15细胞株。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测和蛋白质免疫印迹检测的方法，筛选并获得表达cas9基因的PK-15-Cas9阳性细胞。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，利用荧光显微镜观察转染细胞，筛选并挑取其中呈红色荧光的细胞，即为阳性细胞。

10.如权利要求5所述的胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株在制备抗伪狂犬病毒感染细胞或动物模型中的应用。