[发明专利]一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了来源于微生物Deltaproteobacteria bacterium的甘露糖异构酶作为亲本，利用基因突变技术，第37位的精氨酸替换成赖氨酸和第164位的甘氨酸替换成亮氨酸，得到双突变体R37K/G164L。在温度为60℃时，测得野生酶的半衰期为46.27min,突变体酶R37K/G164L的半衰期为185.83min，两点突变体R37K/G164L在60℃的半衰期为野生酶半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高。这一发现对于研究更多热稳定性甘露糖异构酶具有重要的研究价值。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体，属于酶工程及基因工程技术领域。

背景技术

D-甘露糖是D-葡萄糖在C-2位的差向异构体，也是D-果糖的醛糖异构体。其甜度相当于蔗糖甜度的60％，并且甜度不会随浓度的增加而增加。此外，D-甘露糖热值为3.75kcal/g，低于其他糖类。自然界中D-甘露糖天然存在于甘露聚糖、半纤维素和纤维素中。D-甘露糖具有的这些重要的生理功能，使其可作为膳食补充剂对人体健康做出贡献。D-甘露糖已被证明是合成维生素、抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体。此外，D-甘露糖也被认为是工业生产功能性甜味剂D-甘露糖醇的最佳原料。因此，D-甘露糖在食品和医疗工业中得到广泛应用，近年来引起人们的广泛关注。

目前，D-甘露糖的生产方法主要是天然提取法和化学合成法。例如，利用微波辅助结合硫酸处理法从脱蛋白的棕榈仁中提取D-甘露糖，当底物与溶剂的质量体积比为1：49.6时，在148℃条件下连续处理约10min，D-甘露糖的回收率达到92.11％。在98℃、pH 2.0条件下，55％浓度的D-葡萄糖加入钼酸铵催化剂反应约150min后，可获得32.6％的D-甘露糖。然而，天然提取法由于被提取植物细胞壁中较高的结晶度和聚合作用，使用酸水解和热水解从含甘露聚糖的材料中提取D-甘露糖又需要高温等严格的条件，大大提高了提取成本。另外，D-甘露糖的化学合成涉及复杂的反应，该反应通常在高温和强酸性环境下进行，并且需要用到一种或几种催化剂的参与，在制造过程中增加了副产物和有害污染物的产生。

生物转化法因其温和的反应条件和较少的有害副产物，越来越受到广泛的关注。目前，以D-果糖或D-葡萄糖为底物，可以使用4种类型的酶来生产D-甘露糖：包括D-来苏糖异构酶(D-lyxose isomerase,D-LIase,EC 5.3.1.15)、D-甘露糖异构酶(D-mannoseisomerase，D-MIase,EC 5.3.1.7)、纤维二糖2-差向异构酶(cellobiose 2-epimerase,Cease,EC 5.1.3.11)和D-甘露糖2-差向异构酶(D-mannose 2-epimerase，D-MEase，EC5.1.3)。其中，D-来苏糖异构酶D-LIase和D-甘露糖异构酶D-MIase可以催化D-果糖异构化为D-甘露糖。此外，尽管D-甘露糖2-差向异构酶D-MEase和纤维二糖2-差向异构酶CEase可以催化D-葡萄糖向D-甘露糖的差向异构化，但是该过程产生了较多的副产物D-果糖。

虽然用来生产D-甘露糖的酶很多，但甘露糖异构酶相对于其它生产甘露糖的酶比酶活是最高的，并且生产过程中没有出现其它的副产物。发明人课题组研究发现，来源于微生物Deltaproteobacteria bacterium的甘露糖异构酶从D-果糖转化为D-甘露糖的比酶活为322.3±0.4U/mg；该甘露糖异构酶从D-甘露糖转化为D-果糖的比酶活为764.1±3.9U/mg；在同类甘露糖异构酶中，其比酶活处于较高的位置，但该甘露糖异构酶热稳定不好；并且，现有技术当中，甘露糖异构酶的热稳定性普遍不好；例如，公开于“Pseudomonasgeniculata D-甘露糖异构酶的热稳定性改造及发酵优化”论文中的来源于Pseudomonasgeniculate的甘露糖异构酶在高于50℃的条件下，酶的活性降低的很快，很难满足工业生产的需求，因此迫切需要提供一种热稳定性高的甘露糖异构酶。

发明内容