[发明专利]一种牛源肝素钠的提取精制方法

说明书

本发明涉及一种牛源肝素钠的提取精制方法，将牛源粗品肝素溶解后经盐解、酶解、柱层析离子交换、醇沉、氧化、过滤、沉淀、干燥等步骤制得，本发明开创了国内牛源肝素钠生产先河，使得牛脏器得以充分利用，解决了国内一直以来对猪源肝素的依赖。本发明适于规模化生产，产品质量具有高活性、高分子量、高纯度等优势。

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及牛源肝素钠的提取精制方法，尤其涉及以牛源粗品肝素为起始原料提取精制牛源肝素钠的方法。

背景技术

1939年，全球第一个上市的药用肝素（商品名Liqueamin）来源于牛肺脏，20世纪50年代以来由于猪小肠黏膜的易获得性以及疯牛病的爆发，使得猪小肠来源的肝素钠逐渐成为牛源肝素钠的替代品。但是随着疯牛病得到控制，以及全球市场对肝素产品消费的日益增长，伊斯兰国家对牛源肝素的大量需求，非洲猪瘟导致的生猪数量的锐减，使得牛源肝素钠重返市场的形式迫在眉睫。

我国的贵州贵阳、新疆伊利和库尔勒、河南郑州、福建泉州、吉林长春等地先后尝试牛源粗品肝素的生产，但均因原料来源短缺和粗品销售等原因，无法维持和发展。目前，国内还没有专业化的牛源肝素钠生产厂家，国内纯化牛源粗品肝素的方法较为粗略，制得的牛源肝素钠或者杂质含量较高，或者活性偏低，或者产品收率较低，或者工艺复杂不利于规模化生产。牛源粗品肝素的特点是颜色较深、效价较低，采用传统方法很难获得符合出口标准的产品。

国外市场有少量的牛源肝素，例如巴西的EXTRASUL是牛源肝素钠的原料药和制剂销售公司，Kin Master Produtos Quimicos Ltda.和Wegmed Caminhos Medicinais Ltda.两家公司仅有牛源肝素钠原料药产品；马来西亚的AIN MEDICARE SDN. BHD.和印尼的PTPratapa Nirmala (Fahrenheit)两家公司仅有牛源肝素钠的制剂产品，其原料药从巴西进口。国外仅有屈指可数的几个国家生产经营牛源肝素钠产品，且因原料来源紧张、供不应求而无法满足全球市场需求。

全球穆斯林人口约有20亿，再加上印度教和犹太教等兼容市场，总人口超过23亿，约占全球人口的1/3，对肝素钠的原料需求为每年度50吨左右，市场容量保守估计约为20-30亿美元。牛源肝素钠具有巨大的市场开发潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种可获得高效价、高分子量、高纯度的注射级牛源肝素钠精品的牛源肝素钠的提取精制方法，以克服肝素钠来源于单一物种的限制，满足市场需求，降低肝素钠单一物种来源的风险。

本发明采用如下技术方案：

一种牛源肝素钠的提取精制方法，其包括如下步骤：

（1）盐解：将牛源粗品肝素溶于纯化水中，加入溶液体积1%~5%氯化钠搅拌溶解，将溶液升温至45~55℃，用盐酸调溶液pH值8.0~9.0，保温搅拌1~3h；

（2）酶解：在步骤（1）的反应液中加入反应液质量0.1%~1%的蛋白酶，保温45~55℃酶解3~5h，反应结束，将反应液迅速升温至85~95℃，保温10~30min；然后降温至30℃以下；

（3）柱层析离子交换：将步骤（2）得到的酶解液经离子交换柱吸附，然后用1~2mol/L氯化钠洗涤，洗涤10~15倍柱床体积时停止洗涤，换用5~8倍柱床体积的4~5mol/L氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液；

（4）超滤：使用超滤机将洗脱液超滤浓缩至原体积的1/5~1/4；

（5）醇沉：向步骤（4）所得浓缩液中加入95%乙醇，当加入的乙醇体积为浓缩液体积的0.8~1.2倍时，停止加入，搅拌10~30min，然后在15~35℃下静置，静置3~10h后沉淀物与上清液分层，收集沉淀物；

（6）氧化：将步骤（5）所得沉淀物加水溶解后，用氢氧化钠溶液调节溶液pH为9.0~11.5，然后升温到30~60℃，分3步加入浓度为30%的过氧化氢，氧化8~24h；