[发明专利]多型杜氏藻盐胁迫响应miRNAs及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种多型杜氏藻盐胁迫响应miRNAs及其应用。本发明利用BGISEQ‑500测序平台对生长至30天(成熟期)，高盐(3mol/L)及正常生理盐度(0.05mol/L)条件下的多型杜氏藻进行小RNA及转录组测序分析，获得大量盐胁迫响应相关miRNAs同时，筛选获得与盐胁迫响应紧密相关的miRNA信息，并对其进行了qPCR验证。同时还选取其中显著上调表达的4条miRNAs及其相关序列信息用于多型杜氏藻耐高盐品系筛选以及杜氏藻品种鉴定。本发明结果为多型杜氏藻成熟期盐胁迫调控机制的研究奠定了基础，为多型杜氏藻的人工分子改良及低等植物盐胁迫机制的深入研究具有重要的指导意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为多型杜氏藻盐胁迫响应miRNAs及其应用。

背景技术

盐胁迫是植物界一种非常重要的非生物胁迫，盐胁迫相关研究主要集中在高等陆生植物，对于低等藻类植物的相关研究较少。从低等的耐盐模式藻类中挖掘与盐胁迫响应紧密相关的调控因子及关键基因，并对其区别于高等植物的独特调控方式进行分析，对于低等植物耐盐机理机制的研究很必要。

多型杜氏藻(Dunaliella polymorpha)属杜氏藻的一种，目前多在国外的盐湖、海洋中发现，该杜氏藻细胞没有细胞壁，有的具双鞭毛而能游动，含有一个较大的杯状叶绿体能进行光合作用；可在含有0.05-5mol/L NaCl的盐水中生长，抗逆性极佳，是一种较为理想的抗逆境生物。多型杜氏藻中含有丰富的生物活性物质和藻类色素等高附加值产物，如多糖、甘油、多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等，因此在保健品、食品加工、医疗和生物柴油等方面具有广阔的应用前景，是一类重要的特色特色经济微藻。广谱耐盐的能力、简单的细胞结构、便利的培养条件及独特的营养价值使多型杜氏藻成为生物能源开发、耐盐抗逆性等研究的重要模式生物和藻类遗传学研究的良好实验材料。

多型杜氏藻虽然耐盐，但不同生境地、不同藻株之间的NaCl耐受能力并不相同，这往往与其生长的环境、遗传的变异等因素有关。传统的筛选多型杜氏藻高耐盐品种的方法主要是通过室内不同浓度梯度的盐胁迫培养检验，但这往往受到培养周期长、外部控制条件(防止染菌的同时控制条件需保持一致)及原始藻种本身退化、遗传突变等因素的影响，因此，开发一种灵敏、精准、有效的多型杜氏藻高耐盐品系筛选鉴定技术很有必要。此外，杜氏藻品种鉴定的方法主要是通过形态学特征、保守基因的系统发育分析进行鉴别。因杜氏藻不同生长阶段的形态差异较小、不同品种间保守基因变异较少，因此，利用上述方法鉴定多型杜氏藻往往费时费力、容易受环境和主观因素的影响。因此，建立一套快速、准确、廉价的多型杜氏藻品种鉴定技术亦非常必要。

目前，国内外对于多型杜氏藻的研究多集中于培养条件的优化、关键基因的挖掘、活性物质的提取与加工等方面，对于其小RNA及品种筛选与鉴定方面的研究很少。MicroRNA(miRNA)是生物体内普遍存在的非编码、长度约18～25nt的小分子RNA，在转录后水平通过介导靶mRNA降解或翻译抑制调控基因表达，从而作为一类重要调控因子参与植物生长发育、信号转导、新陈代谢、胁迫响应等过程的调控。很多研究证实，一些miRNA对于植物的盐胁迫响应具有十分重要的调控作用。

进入21世纪以来，随着国内外高通量测序技术的快速发展，先后出现了以IonTorrent、Roche 454、Thermo Fisher、SOLiD、HiSeq为代表的高通量测序平台，这为多型杜氏藻miRNA的鉴定提供了条件。对多型杜氏藻进行小RNA测序，是获取该物种在盐胁迫响应下关键miRNA的重要手段之一。BGISEQ-500是国内自主生产的新一代高通量测序平台，利用该测序平台进行小RNA及转录组测序研究已在多个植物物种包括低等藻类植物中报道。

发明内容

针对上述问题本发明提供了多型杜氏藻盐胁迫响应miRNAs及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：