[发明专利]一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用

说明书

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用。本发明通过对来源于毛竹胚性愈伤组织的原生质体进行培养，诱导其再生出完整的细胞壁，再生效果优良且成功率高，同时再生结果还具有较高的重复性。此外，利用本发明的方法还可以对原生质体及细胞壁再生过程进行监测，为研究毛竹以及其他物种细胞壁合成与调控机理、材质改良以及生物质能源等领域的研究提供切实可行的模型，为改善竹材细胞壁的质量与产量提供了理论指导，对竹产业的建设发展具有深远影响和长远意义。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用。

背景技术

随着社会经济的飞速发展，人类对竹产品的需求激增。近年来，对竹子材性改良及优良竹种选育等研究工作进展缓慢，成为限制竹产业发展的关键因素。

植物细胞壁是存在于植物细胞外围的一层厚壁结构，由胞间层、初生壁、次生壁三部分构成，主要成分为多糖物质。细胞壁主要参与维持细胞的一定形态、增强细胞的机械强度，并且还与细胞的生理活动有关。部分植物细胞在停止生长后，其初生壁内侧继续积累的细胞壁层，位于质膜和初生壁之间，称作次生壁。细胞壁内填充和附加了木质素，可使细胞壁的硬度增加，细胞群的机械力增强。因此研究毛竹细胞壁的生物合成及调控机制，对竹材机械性能改良、竹材定向培育、竹笋保鲜以及林业、造纸等化工业都十分重要。

原生质体作为一项传统的细胞工程技术，在农林作物改良和遗传育种领域占有重要地位。同时，原生质是构成细胞的生命物质，在原生质体的培养过程中，作为一种裸露的细胞，是研究细胞代谢、物质转移和信息传递的优质实验材料。在合适的培养条件下，原生质体能够完成细胞壁的重构过程，是研究细胞壁合成的最佳材料。

1880年，Hanstein提出植物原生质体的概念。1892年，Klercher等通过诱导植物细胞发生质壁分离，采用机械切割的方法获得原生质体，但耗时费力，分离原生质体的效率低下。

在植物原生质体培养时，常用含有果胶酶和纤维素酶的酶混合液处理植物组织，以破坏胞间层和去掉细胞的纤维素外壁，得到游离的裸露原生质体。1960年，Cocking提出酶解法分离植物原生质体并获得成功，大大提高了原生质体的获取效率，为研究原生质体系统奠定了基础(Cocking EC(1960)A method for the isolation of plantprotoplasts and vacuoles.Nature,187:962-963)。

荧光增白剂(Calcofluor white)是一种荧光染料，对β-1,4-葡聚糖具有高度亲和力，可以对纤维素进行特异性染色，在荧光显微镜下观察能发出蓝色荧光，可以被用来证明原生质体细胞壁的再生。

1970年，Nagata和Takebe使用荧光增白剂Calcoflur对无菌培养3天的烟草原生质体进行染色，观察到细胞壁发出的蓝色荧光，证明了原生质体细胞壁的再生(Nagata T,Takebe I(1970)Cell wall regeneration and cell division in isolated tobaccomesophyll protoplasts.Planta,92(4):301-308)。

1990年，Huang等利用酶解法，分离出蓬莱竹(Bambusa multiplex)和绿竹(Bambusa oldhamii)愈伤组织的原生质体，进行了原生质体的培养，观察到原生质体的持续分裂，证实了禾本科单子叶竹类植物原生质体培养的可行性(Huang LC,Huang BL,ChenWL(1990)Tissue-culture investigations of bamboo 5recovery of callus fromprotoplasts of suspension-cultured Bambusa cells.Botanical Bulletin ofAcademia Sinica,31:29-34)。