[发明专利]一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用

权利要求书

1.一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，其包括：

(1)将经过消毒的毛竹种子接种在愈伤诱导培养基中培养，以诱导得到胚性愈伤组织；

所述愈伤诱导培养基中含有MS培养基、4-6mg/L 2,4-D、300-500mg/L脯氨酸、300-500mg/L谷氨酰胺、100-300mg/L水解酪蛋白、50-100mg/L肌醇、50-100mg/L PVP-40、25-35g/L蔗糖、2-2.5g/L植物凝胶、200-300mg/L头孢霉素，pH值为5.75-5.80；

(2)将所述胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中培养，并将长出新的愈伤组织剥离并进行酶解，以得到游离的裸露原生质体；

所述愈伤组织增殖培养基中含有MS培养基、1-3mg/L 2,4-D、300-500mg/L脯氨酸、300-500mg/L谷氨酰胺、100-300mg/L水解酪蛋白、100-200mg/L肌醇、50-100mg/L PVP-40、5-10mg/L抗坏血酸、25-35g/L蔗糖、2-2.5g/L植物凝胶，pH值为5.75-5.80；

在所述酶解中，所使用的酶解液中含有2.0±0.5％的纤维素酶Cellulose R-10、1.0±0.5％的半纤维素酶Hemicellulase、1.0±0.5％的离析酶Macerozyme R-10、1.0±0.5％的果胶酶Pectolyase Y-23、0.5-0.7M的甘露醇、18-22mM的MES、18-22mM的KCl、0.008-0.012M的CaCl₂、0.18-0.22％的BSA，pH值为5.75-5.80；

(3)利用预冷的改良的原生质体培养基重悬原生质体，并进行活化处理；

所述改良的原生质体培养基中含有1.5-2.5mg/L的2,4-D和0.15-0.25mg/L的6-BA；所述活化处理具体为：在43-47℃热激处理4.5-5.5min，然后在-2～4℃处理5-15s；

(4)将活化处理后的原生质体接种于所述改良的原生质体培养基进行培养；

步骤(3)-(4)中，所述改良的原生质体培养基是以KM8p培养基为基础，添加35-45g/L甘露醇、15-25mL/L椰乳、0.20-0.30g/L酶水解酪蛋白、1.5-2.5mg/L的2,4-D、0.15-0.25mg/L的6-BA，pH值为5.75-5.80。

2.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，通过以下方式对毛竹种子进行消毒：

将去掉种皮的毛竹种子在流水中冲泡20-28h后，用180-220mg/L的赤霉素溶液再浸泡1.5-2.5h，剪去其尾部；而后在超净台中，将种子用70-80％酒精浸泡0.5-1.5min后，用无菌水清洗；然后用含1.8-2.2％有效氯和0.04-0.06％吐温-20的次氯酸钠消毒液浸泡18-25min，用无菌水清洗；再用含0.04-0.06％吐温-20的0.1％氯化汞浸泡18-25min，最后用无菌水清洗；

和/或，步骤(1)中，在每个培养器皿中单独接种一个经过消毒的毛竹种子。

3.根据权利要求1或2所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，所述酶解的条件为24±2℃、80-120rpm/min下避光酶解。

4.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，在步骤(2)中的酶解结束后，将酶解液冷却至0-6℃，而后与预冷的W5溶液混合，并用80-120目的细胞筛过滤混合液；收集滤液并在0-6℃、400-600g离心5-10min，弃上清；而后再利用预冷的改良的原生质体培养基重悬沉淀。

5.根据权利要求4所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，所述W5溶液中含有8-10g/L的NaCl、0.12-0.13M CaCl₂、4-6mM KCl、1.5-2.5mM MES和1.5-2.0g/L的葡萄糖。