[发明专利]一种核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用

说明书

本发明公开了一种核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用。本发明所述核酸聚合酶底物类似物的混合物包含两种及以上核酸聚合酶底物类似物；所述核酸聚合酶底物类似物是在分子内形成互补配对的单个寡聚核酸分子或核酸分子类似物，或者是在分子间形成互补配对的单个或两个寡聚核酸分子或核酸分子类似物；所述核酸聚合酶底物类似物所形成的结构具备核酸聚合酶底物的特征；所述核酸聚合酶底物类似物的3’端具有抑制其延伸的修饰。本发明提供的核酸聚合酶底物类似物的混合物，能更有效地减少核酸聚合酶在一定温度下的酶活性，并且适用于所有类型的核酸聚合酶，通用性强。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至变性温度(通常≥90℃)一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至退火温度(通常≥55℃)，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在延伸温度(通常≥60℃)、DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。在很短时间内就能将待扩目的基因扩增放大几百万～几十亿倍。

虽然PCR技术已经在生物医药领域得到广泛应用，但由于PCR副反应导致的非特异性扩增常常带来较大问题。特别是在临床诊断领域，需要在大量背景DNA下扩增微量的目的DNA，此时的非特异性扩增会导致假阳性。而非特异性扩增产生的很大原因，是由于酶在室温下延伸了非特异性退火的引物。因此，抑制聚合酶在室温条件下的活力，可以很大程度上减少非特异性扩增。

为了减少甚至避免操作过程中产生非特异性扩增，人们发明了热启动聚合酶链式反应，开发并使用了热启动聚合酶，热启动酶是能够通过热启动的方式避免低温下体系中发生错配，原理就是采用化学修饰或者抗体修饰的方法封闭酶的活性，化学修饰是利用一些分子基团(如酸酐、活化酯、醛等化学分子)和酶共价结合，温度到达一定温度时(一般是90度以上温度)，小分子脱离开酶，此时发挥活性，实现核酸扩增，但化学修饰热启动酶性能需要高温保温逆转修饰，不适用于热不稳定的酶(如反转录酶)的修饰，同时需要逆转保温的时间长且不完全；而抗体修饰是以所修饰的聚合酶为抗原免疫实验动物产生相对应的抗体，经过一系列的筛选后，通过单克隆抗体技术大规模制备该抗体，并利用抗体的蛋白生物活性使其在PCR反应高温条件下失活、脱落，从而达到热启动的效果，但特定抗体的产生需要非常长的筛选周期，而且抗体修饰易带来外源DNA的污染。抗体与聚合酶的解离通常在高温，因此不适用于不耐高温的聚合酶如反转录酶。

美国专利(US6183967、US6020130)公开了与热稳定Taq酶，Tth酶，和TZ05酶特异性结合的寡核苷酸适配体，这些适配体能在室温下封闭聚合酶的活性。筛选适配体的过程一般包括五个基本的步骤，即：结合、分离、洗脱、扩增和调节，再通过迭代循环得到目标适配体，整个筛选需要非常长的周期，过程相对较慢和复杂。并且由特定方法筛选的适配体对相应的配体(聚合酶)具有高度专一性，因此不同的聚合酶需要不同的适配体。

虽然我们已经发明了一种核酸配体及其应用(申请号：202010576818.3)，它能有效减少室温下核酸聚合酶导致的非特异性扩增，但单独使用(仅使用一种核酸聚合酶底物类似物)时，核酸聚合酶仍残存有少量酶活性。

因此需要一种能更好地抑制核酸聚合酶在一定温度下的酶活性的产品。本发明采用核酸聚合酶底物类似物的混合物更好地抑制了核酸聚合酶在一定温度下的酶活性。

发明内容