[发明专利]一种无细胞翻译体系、方法及产物

说明书

本文涉及技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种无细胞翻译体系、方法及产物。所述翻译体系包括：5’帽子及3’多聚腺苷酸的mRNA、氨基酸混合物、能量分子、mRNA翻译酶源的混合物；所述能量分子包括磷酸肌酸、ATP和鸟苷三磷酸(GTP)。所述翻译体系经过mRNA转录、体外转录和凝胶电泳分析确定可以迅速获得大量目的蛋白并具有以下特点：采用细胞外翻译技术克服了原核细胞表达部分基因不能表达问题；采用细胞外翻译技术克服了真核细胞表达周期长效率低问题；采用添加磷酸肌酸等能量小分子的策略优化了原有细胞外翻译技术的活性低、效率差问题；采用5’帽子及3’多聚腺苷酸的mRNA增强稳定性和与受体结合速度及整体翻译速度。

技术领域

本技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种无细胞翻译体系、方法及产物。

背景技术

基因表达的最终产物除了非编码RNA之外主要以蛋白质的形式存在，现有的蛋白质表达技术主要有原核细菌表达，真核昆虫细胞表达、人源工程化细胞表达。本发明发明人发现：原核细胞表达的主要优势是成本低廉，但很多蛋白在原核中不能表达；真核细胞表达效率较高，但目前存在成本高昂，时间周期较长的问题；现有细胞外翻译技术由于存在活性低、效率低、经济性差等问题。

发明内容

本发明研究人员通过研究发现，5'端“帽子”结构作用：

(1)稳定mRNA的一级结构，防止mRNA被5'-核酸外切酶所水解；

(2)为mRNA识别核糖体提供信号，使mRNA较快地与核糖体结合，以提高mRNA对蛋白质的合成效率；

3'端polyA尾巴结构的功能

(1)有助于mRNA从细胞核向细胞质转移；

(2)对蛋白质的合成速度有影响；

(3)与保护mRNA的稳定性和维持mRNA的二级结构有关。

进一步地，本发明研究人员通过研究发现，真核细胞mRNA在细胞外翻译存在效率较低问题，主要受制于酶体系：mRNA翻译需要复杂的酶体系，人工组合酶体系往往难以完全切合细胞内真实体系组成，因而制约细胞外翻译效率。

进一步地，本发明研究人员通过研究发现，真核细胞mRNA在细胞外翻译存在效率较低问题，主要还受制于供能体系：使用真核细胞裂解液提供全酶体系下使用常用ATP，依然无法获得较高翻译效率，其原因在于真核细胞mRNA翻译供能和原核生物不同，除了ATP外还需要鸟苷三磷酸和磷酸肌酸等供能物质。

本发明实施方式的目的在于提供一种无细胞翻译体系，包含：5’帽子及3’多聚腺苷酸的mRNA、氨基酸混合物、能量分子、mRNA翻译酶源；所述能量分子包含磷酸肌酸。

所述能量分子还包括ATP和鸟苷三磷酸(GTP)。

优选的，所述mRNA翻译酶源包含真核细胞裂解上清液；所述氨基酸混合物包含丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的混合物。

优选的，所述mRNA翻译酶源包含真核细胞裂解上清液。

一种无细胞翻译方法，包含以上翻译体系，包含以下步骤：

步骤(1)转录具有5’帽子及3’多聚腺苷酸的mRNA；

步骤(2)向反应容器内加入所述mRNA、氨基酸混合物、能量分子及mRNA翻译酶源，反应制得含有目的蛋白的混合溶液一；

步骤(3)将所述混合溶液一处理得目的蛋白。