[发明专利]一种口蹄疫的三价重组腺病毒疫苗及其构建方法

权利要求书

1.一种口蹄疫的三价重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为通过构建一种口蹄疫病毒的三种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经AY293-6015细胞包装而获得；

所述三种抗原基因分别为A-P12A、OBY-P12A和OXJ-P12A3C-mutant，其中A-P12A和OBY-P12A表达在E1区，通过口蹄疫病毒自带的2A酶切位点连接，OXJ-P12A3C-mutant表达在E4区，三种口蹄疫结构蛋白共用1个3C蛋白酶，构成三种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5-A-OBY-OXJ-3Cmutant；

其中，所述重组腺病毒载体pAd5-A-OBY-OXJ-3Cmutant需通过由AY293-6015细胞实现重组腺病毒包装；AY293-6015细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2019111，保藏于中国典型培养物保藏中心；

其中，A-P12A、OBY-P12A、OXJ-P12A3C-mutant和pAd5分别具有如序列表中Seq IDNO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的一种口蹄疫病毒的三种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒；

2)再利用CRISPR/cas9敲除步骤1)获得的腺病毒载体质粒的E4基因，使用PCR扩增并引入酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5；

3)构建腺病毒E1区域穿梭质粒，pS5E1载体与A-P12A序列、OBY-P12A序列用T4连接酶连接，获得腺病毒载体E1区域穿梭质粒pS5E1-A-OBY；

4)构建腺病毒E4区域穿梭质粒，扩增OXJ-P12A3C-mutant基因，通过对穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通过T4连接酶与OXJ-P12A3C-mutant连接，构建腺病毒载体E4区域穿梭质粒pS5E4-OXJ-P12A-3Cmutant；

5)将穿梭质粒pS5E1-A-OBY、pS5E4-OXJ-P12A-3Cmutant与pAd5同源重组，构建腺病毒载体质粒pAd5-A-OBY-OXJ-3Cmutant，pAd5-A-OBY-OXJ-3Cmutant具有如序列表中Seq IDNO.5所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtViral DNAExtract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环状的腺病毒环状载体质粒。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的pS5E1载体先与A-P12A序列酶切连接，并转化大肠杆菌，筛选后提取质粒pS5E1-A-P12A；再将质粒pS5E1-A-P12A与OBY-P12A酶切连接，并转化大肠杆菌，筛选后提取腺病毒载体E1区域穿梭质粒pS5E1-A-OBY。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的OXJ-P12A3C-mutant是将OXJ-P12A和OXJ-3C-mutant进行无缝克隆连接而获得，所述的OXJ-3C-mutant是由OXJ-3C的第127个氨基酸由L变为P而获得，所述的OXJ-3C、OXJ-P12A、OXJ-3C-mutant具有如序列表Seq ID NO.6、Seq ID NO.7、Seq ID NO.8所示的核苷酸序列。