[发明专利]表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法

权利要求书

1.一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法包括以下步骤：

步骤一，进行鲁氏杆菌抗体分组；

步骤二，制备纳米材料；

步骤三，制备SERS标记检测探针；

步骤四，制备拉曼免疫层析试纸条；

步骤五，进行试纸条性能检测。

2.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤一中，所述鲁氏杆菌抗体分组，包括：将获得的一对鲁氏杆菌抗体所包含的鲁氏杆菌标记抗体和鲁氏杆菌捕获抗体两个鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用。

3.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤二中，所述制备纳米材料，包括：选择步骤一获得的其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20-35nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8-12mM的DTNB，搅拌反应3-6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5-1.5％w/v的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5-1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10-20min，得到Au/DTNB@Ag NPs；向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5-5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料。

4.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤三中，所述制备SERS标记检测探针，包括：向步骤二制备得到的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，用1.5-2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育1.3-2.5h；加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，加入用SERS检测探针复溶液重悬，制备得到布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子；对布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20-40℃恒温环境下干燥3h后，即可得到SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针；

其中，所述EDC使用量为2.0-3.5μL，所述NHS使用量为2.0-3.5μL，所述BSA使用量为90-120mL。

5.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤四中，所述制备拉曼免疫层析试纸条，包括：将步骤一剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30-40℃恒温环境下干燥，其中布鲁氏杆菌抗体检测探针作为检测线T，羊抗鼠抗体作为质控线C；将干燥后的硝酸纤维素膜与步骤三制备的含SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；

其中，所述布鲁氏杆菌抗体检测探针稀释后浓度为0.3-0.7mg/mL，所述羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3-0.7mg/mL。

6.如权利要求5所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，所述制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板；所述试纸条优化宽度为2-4cm，优化长度为5-10cm。

7.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤五中，所述试纸条性能检测，包括：采用国家标准品对步骤四所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察，通过临床样品对步骤四所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测，进而实现对步骤四所制备检测试纸条检测性能的全面评测。