[发明专利]一种基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法

说明书

本发明公开了一种基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法。将PAMAM进行生物素修饰，再结合抗诺如病毒抗体，得到PAMAM‑biotin‑mAb，然后将PAMAM‑biotin‑mAb添加到牡蛎提取液中孵育，再加入链霉亲和素包被的磁珠孵育，然后磁分离，洗脱获得富集的牡蛎中诺如病毒。基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集方法，可以特异高效捕获牡蛎中的目标诺如病毒，是对传统富集方法非特异性的重要弥补，富集效率与检测周期均优于常规免疫磁富集方法。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法及其应用。

背景技术：

诺如病毒(Norovirus，NoV)是急性肠胃炎的主要致病原因之一，尤易引起群体性食品安全事件的暴发，造成高危人群的脱水性死亡，社会与经济损失巨大。牡蛎是滤食性动物，诺如病毒颗粒容易在其消化道中积聚。牡蛎的生食增加了诺如病毒传播的速度。因此牡蛎中的诺如病毒污染的诊断对于控制病毒暴发和确保患者获得最佳治疗至关重要。RT-qPCR是诺如病毒诊断和检测的“金标准”。但是，这种方法通常会受到牡蛎样品中诺如病毒含量较低和牡蛎组织中抑制剂的影响。因此，有必要建立一种有效的诺如病毒富集方法排除两者的干扰。传统的富集方法包括直接处理、聚乙二醇沉淀法和蛋白酶K法等都是非特异性的，不适合基质复杂的样品及大规模样品处理。

免疫磁富集(Immunomagnetic enrichment，IME)技术广泛应用于复杂样品中目标微生物的前处理检测，并且该过程比传统的非特异性前处理方法更有效。免疫磁富集法是以磁性微球作用固相表面，用于从复杂的基质中富集目标并显着提高系统的捕获率。此法操作步骤简单、样品处理时间短，广泛应用于病毒检测中，它可以有效的去除样本中的PCR抑制物。但传统的IME是将磁珠与抗体结合在一起，从复杂的基质中富集靶标物，该方法简单有效，但是体系很容易受到pH和偶联时间微小变化的影响。链霉亲和素(Streptavidin,SA)-生物素介导的IME因其高亲和力和特异性而获得了广泛的应用，SA是由相同亚基组成的四聚体蛋白，因此一个SA分子可以与四个生物素分子结合，在稳定的同时实现了信号的放大。

聚酰胺基胺(PAMAM)是一种具有大量可用于表面修饰(例如乙酰化，糖基化)的官能团的树状聚合物，具有良好的生物相容性，可以作为药物和基因的偶联载体，在生物学和医学领域具有良好的应用前景。

发明内容：

针对现有技术的特异性差、灵敏度低、耗时长等问题，本发明提供了一种基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法。

本发明的基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法，包括以下步骤：

将PAMAM进行生物素修饰，再结合抗诺如病毒抗体mAb，得到PAMAM-biotin-mAb，然后将PAMAM-biotin-mAb添加到牡蛎提取液中孵育，再加入链霉亲和素包被的磁珠孵育，然后磁分离，洗脱获得富集的牡蛎中诺如病毒。

优选，所述的PAMAM-biotin-mA、链霉亲和素包被的磁珠的用量质量比为40:60。

优选，所述的将PAMAM-biotin-mAb添加到牡蛎提取液中孵育，再加入链霉亲和素包被的磁珠孵育是每0.8～1ml牡蛎提取液中添加40μg PAMAM-biotin-mAb，孵育15～45min，再加入60～120μg链霉亲和素包被的磁珠孵育20～50min。

进一步优选，所述的将PAMAM-biotin-mAb添加到牡蛎提取液中孵育，再加入链霉亲和素包被的磁珠孵育是每0.8～1ml牡蛎提取液中添加40μg PAMAM-biotin-mAb，37℃孵育15min，再加入60μg链霉亲和素包被的磁珠37℃孵育20min。