[发明专利]一种自单细胞或微量RNA生成并扩增cDNA的方法和试剂盒

说明书

本发明提供一种自单细胞或微量RNA生成并扩增cDNA的方法和试剂盒及其应用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。尤其，本发明提供一种自单细胞或微量RNA生成并扩增cDNA的方法和试剂盒。本发明还涉及本发明方法和试剂盒的应用，例如对所得cDNA进行3′和5′双向RACE、常规测序、下一代测序、转录组建库等等，例如用于优生优育中的胎检、疾病(例如癌症)筛查、辅助生殖和细胞疗法中的细胞筛查等等。

背景技术

RACE(rapid amplification of cDNA ends，cDNA末端快速扩增)是一种基于逆转录PCR从转录本中快速扩增cDNA的末端的技术。RACE包括3′RACE和5′RACE。利用含polyT的引物作为逆转录引物，根据基因的已知序列设计基因特异性引物，利用3′RACE获得3′端序列，利用5′RACE获得5′端序列，最终通过组装获得完整的cDNA序列。

RACE流程主要包括以下步骤：RNA提取，逆转录，3′或5′末端扩增，克隆转换，测序分析。目前，传统RACE以3′RACE和5′RACE两个流程分开进行，在逆转录过程中需要分别使用不同的含polyT寡核苷酸作为逆转录引物进行逆转录，后续分开进行3′RACE和5′RACE。

传统RACE对总RNA的起始量有要求，一般是10ng至1μg。而且，当前无法实现单细胞的RACE，因为单细胞的总RNA含量不满足传统RACE的要求。

因此，提供一种能够对单细胞或微量RNA进行RACE的方法，对于转录组测序技术的发展具有重要的意义。

发明概述

本发明提供一种自单细胞或微量RNA生成并扩增cDNA的方法和试剂盒。本发明还涉及对所得cDNA进行5′RACE和3′RACE。

本发明能够解决传统RACE要求RNA起始量高的限制(单向RACE需要至少1ng总RNA)，能以单个细胞的裂解物或低至5pg的总RNA为起始物进行双向RACE。本发明可以以1至5000个细胞的裂解物或5pg至5μg的总RNA为起始物。本发明也可以以少数细胞，甚至单个细胞为起始物。这克服了单细胞RNA含量低，且提取困难的问题。

本发明能够解决传统5′RACE和3′RACE需要分两次逆转录，流程复杂的问题，能以一次逆转录支持后续同时进行5′RACE和3′RACE，且操作流程简单。

本发明还能够解决传统转录组测序无法获得完整转录本末端的缺陷。

本发明的方法整个流程只需要3-5个小时，为分析单细胞、少数细胞或微量RNA提供了一种快速的5′和3′RACE方式，对在肿瘤检测、新基因的认知等方面具有重要的应用前景。

一方面，本发明提供一种自微量RNA样本生成cDNA的方法，其包括：

(1)以样本中的mRNA为模板，以逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cDNA一链；

(2)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；和

(3)以转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cDNA一链得到全长cDNA。

另一方面，本发明提供一种自微量RNA样本生成并扩增cDNA的方法，其包括：

(1)以样本中的mRNA为模板，以逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cDNA一链；

(2)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

(3)以转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cDNA一链得到全长cDNA；和

(4)以全长cDNA为模板，以5′全长扩增引物和3′全长扩增引物为引物，利用DNA聚合酶活性扩增全长cDNA。