[发明专利]一种自单细胞或微量RNA生成并扩增cDNA的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种自微量RNA样本生成cDNA的方法，其包括下述步骤：

(1)以样本中的mRNA为模板，以逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cDNA一链，

其中，所述逆转录引物含有polyT，或由其组成，

任选地，所述逆转录引物还含有位于所述polyT的3'端的锚定碱基V或VN，V代表A、C和G，N代表A、C、T和G；

(2)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；和

(3)以转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cDNA一链得到全长cDNA，

其中，所述转换模板含有oligoG，或由其组成，

任选地，所述oligoG的3'端第一个G是LNA修饰的dG且第二个和第三个G是rG。

2.一种自微量RNA样本生成并扩增cDNA的方法，其包括下述步骤：

(1)如权利要求1中所述的步骤(1)，其中，所述逆转录引物还含有位于所述polyT的5'端的3'接头序列；

(2)如权利要求1中所述的步骤(2)；

(3)如权利要求1中所述的步骤(3)，其中，所述转换模板还含有位于所述oligoG的5'端的5'接头序列；和

(4)以全长cDNA为模板，以5′全长扩增引物和3′全长扩增引物为引物，利用DNA聚合酶活性扩增全长cDNA，

其中，所述5′全长扩增引物包含5'接头序列，或由其组成；所述3′全长扩增引物包含3'接头序列，或由其组成；任选地，所述5'接头序列与所述3'接头序列相同或不同。

3.一种对微量RNA样本进行5′RACE和3′RACE的方法，其包括下述步骤：

(1)如权利要求2中所述的步骤(1)；

(2)如权利要求2中所述的步骤(2)；

(3)如权利要求2中所述的步骤(3)；

(4)任选地，如权利要求2中所述的步骤(4)；和

(5)以全长cDNA为模板，以5′RACE通用引物和5′RACE基因特异性引物为引物，利用DNA聚合酶活性扩增全长cDNA的5′端序列，和/或，以全长cDNA为模板，以3′RACE通用引物和3′RACE基因特异性引物为引物，利用DNA聚合酶活性扩增全长cDNA的3′端序列，

其中，所述5′RACE通用引物包含5′接头序列，或由其组成，所述3′RACE通用引物包含3′接头序列，或由其组成，

任选地，所述5′RACE通用引物还包含位于所述5′接头序列的5′端的5′衔接头序列，所述3′RACE通用引物还包含位于所述3′接头序列的5′端的3′衔接头序列，任选地，所述5′衔接头序列与所述3′衔接头序列相同或不同，

进一步任选地，所述5′RACE通用引物与5′RACE通用短引物组合使用，所述5′RACE通用短引物包含5′衔接头序列，或由其组成，所述3′RACE通用引物与3′RACE通用短引物组合使用，所述3′RACE通用短引物包含3′衔接头序列，或由其组成。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述逆转录活性、所述末端转移活性和所述模板转换活性全部来自逆转录酶，例如MMLV，和/或，所述DNA聚合酶活性来自高保真DNA聚合酶，例如Pfu。

5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述步骤(1)至步骤(3)一起在42℃进行90分钟，任选地，所述步骤(1)包含在先的72℃变性3分钟，和/或，所述步骤(3)包含在后的70℃灭活15分钟。

6.如权利要求2或3所述的方法，其中，所述步骤(4)如下进行：98℃预变性1分钟；5-30个循环，98℃变性10秒，65℃退火15秒，72℃延伸1-30分钟；72℃再延伸5分钟。

7.如权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(5)如下进行：98℃预变性1分钟；5个循环，98℃变性10秒，72℃延伸3分钟；5个循环，98℃变性10秒，70℃退火15秒，72℃延伸3分钟；20或25个循环，98℃变性10秒，68℃退火15秒，72℃延伸3分钟；72℃再延伸5分钟。