[发明专利]一种针对悬浮细胞的慢病毒载体及其应用

说明书

本发明公开了一种针对悬浮细胞的慢病毒载体及其应用，属于生物技术领域。本发明中的慢病毒载体是以pLVX‑EGFP‑IRES‑Puro为框架，插入了Ubi启动子和Cbh启动子。该慢病毒载体普遍适用于悬浮细胞的表达，表达效率高效、稳定，能够极大程度地提升悬浮细胞中的过表达效果，且表达过程简单易行，易于推广。

技术领域

本发明涉及一种针对悬浮细胞的慢病毒载体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

慢病毒(lentivirus,LV)是目前细胞及模式生物实验中非常有效的工具，在基因转染方面有着许多独特的优势。关于慢病毒载体(Lentiviral vector)的研究发展得很快，研究得也非常深入。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。

慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

与其他逆转录病毒相比，慢病毒有其独特的优点。

(1)有更广泛的宿主，对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，使目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。

(2)稳定表达。慢病毒可以将外源基因有效的整合到细胞染色体中，且目的基因对转录沉默作用有一定的抵抗能力，可以在靶细胞中得到持续高效稳定的表达。

(3)经过构建后的慢病毒载体可以携带大约5kb，甚至更长的目的基因。因此除了外源的short-hairpin RNAs(shRNAs)等小分子外，很多cDNA也能被克隆进入慢病毒载体，当然随着目的基因长度的增加，其病毒滴度也会随之下降。

基于慢病毒的优点，可以利用慢病毒载体系统进行转染目的基因或RNAi基因的常规实验操作，同时慢病毒在基因编辑、基因治疗、转基因动物、药物研究等领域也发挥着重要作用。

常见的血液肿瘤主要包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤，目前发病率都排在恶性肿瘤的前十位。因此血液肿瘤是当前的研究热点之一。但是众所周知，血液来源的悬浮细胞，普遍存在难以慢病毒感染的问题。

所以，开发一种悬浮细胞专用的慢病毒载体，有很高的临床和市场价值。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种针对悬浮细胞的慢病毒载体及其应用，该慢病毒载体适用于悬浮细胞的表达，表达效率高效、稳定，能够极大程度提升悬浮细胞中过表达效果，且表达过程简单易行，易于推广。

本发明的技术方案如下。

本发明提供了一种慢病毒载体，是以pLVX-EGFP-IRES-Puro为框架，插入了Ubi启动子和Cbh启动子。

进一步地，所述Ubi启动子和Cbh启动子替换了pLVX-EGFP-IRES-Puro中的CMV启动子。

进一步地，所述Ubi启动子和Cbh启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了含上述慢病毒载体的重组慢病毒。

本发明还提供了一种上述重组慢病毒的制备方法，是将目的基因导入上述慢病毒载体得到目的质粒，将目的质粒与psPAX2和pMD2.G共转染宿主细胞得到的重组慢病毒。