[发明专利]一种祁术成熟胚高效离体再生体系建立的方法

说明书

本发明公开一种祁术成熟胚高效离体再生体系建立的方法，包括以下步骤：种子的选取与预处理，将低温等离子体活化水应用到预处理过程中；将预处理后的成熟胚，接种于不定芽诱导培养基中，进行不定芽的诱导培养；将诱导出不定芽的成熟胚转接于增殖培养基中进行不定芽的增殖培养；将增殖的不定芽丛切成适宜大小的切块，转接于伸长培养基中进行不定芽的伸长培养；待不定芽长至2～3cm并伴有完整叶片时，转入生根培养基中进行生根培养，最终获得完整的祁术再生植株。本发明将低温等离子体活化水应用到预处理过程中，然后通过直接诱导丛生芽再生来实现对祁术种苗的快速繁殖，为祁术种苗的高效繁育及规模化生产提供了有力的技术保证。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种祁术成熟胚高效离体再生体系建立的方法。

背景技术

祁术为菊科苍术属多年生宿根药用植物，因产于祁门而得名，其根茎可入药，是祁门最具代表性的中药材之一，也为安徽道地名贵药材。大量中医临床研究表明，祁术性温、味甘，微苦，除具有一般白术健脾益气、燥湿利水、养神、安胎、消除疲劳等功效外，对黄疸病、心脏病、胃溃疡及腹水病具有显著的治疗效果。除了具有名贵药材属性以外，祁术还可作补品直接食用，经与炒过的芝麻或黄豆、糯米等混合碾粉，可制成“祁术糕”，久病者食用能较快康复，无病者食用则能延年益寿。基于其疗效显著且药效持久，补而不腻，祁术被世人用作珍贵药材补品。此外，祁术还广泛用于美容护肤等行业，具有广阔的市场应用前景。

由于祁术对生长环境的要求较高，性喜凉爽，忌高温、积水，其生长区域仅局限于黄山海拔1000m以上且土质肥沃的背阴山坡、沟谷林地及灌木丛。此外，由于祁术生长缓慢，开花结种较少，部分种子不具备活力，且随着民间采挖量日增，祁术的生态环境严遭破坏，导致在自然生态环境中野生祁术分布极其稀少。目前，在生产上，祁术通常采用传统的播种方式进行繁殖，但存在种子萌发率低，种苗抵抗力弱，容易受到立枯病和根腐病等多种病虫害的危害等问题。此外，通过利用根茎对祁术进行繁殖也是可行的，但由于根茎作为祁术药用的主要部位，通过此种方式进行繁殖存在成本高、繁殖速度慢、繁殖受材料限制，且易引入病害等问题。目前，利用组织培养技术对祁术进行繁殖的研究已有报道，但繁殖过程存在消毒不彻底，繁殖系数低等问题，严重限制了祁术种苗的规模化生产与推广应用。针对祁术繁育现有技术所存在诸多问题，急需开发一种祁术成熟胚高效离体再生体系建立的方法，以满足对祁术种苗的快速繁殖和品种改良的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于如何满足对祁术种苗的快速繁殖和品种改良的需求。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：一种祁术成熟胚高效离体再生体系建立的方法，包括以下步骤：

(1)种子的选取与预处理，将选取的种子用过滤灭菌的低温等离子体活化水浸泡2～4min，然后用无菌滤纸吸干种子表面水分，备用；

(2)将预处理后的成熟胚，接种于不定芽诱导培养基中，进行不定芽的诱导培养；

(3)将诱导出不定芽的成熟胚转接于增殖培养基中进行不定芽的增殖培养；

(4)将增殖的不定芽丛切成适宜大小的切块，转接于伸长培养基中进行不定芽的伸长培养；

(5)待不定芽长至2～3cm并伴有完整叶片时，转入生根培养基中进行生根培养，最终获得完整的祁术再生植株。

本发明将低温等离子活化水应用到祁术种子的预处理过程中，在降低污染率的同时，加快成熟胚再生的启动，通过直接诱导丛生芽再生来实现对祁术种苗的快速繁殖。

优选地，所述步骤(1)种子的选取与预处理是指选取有活力的成熟饱满的祁术种子，将其置于250ml塑料培养瓶中，于流水下冲洗10～20min。然后将种子置于无菌操作台中，用无菌水冲洗3～4遍后，用75％无水乙醇进行2次表面消毒，每次消毒15～20s，2次之间用无菌水冲洗2～3遍；然后用0.1％(w/v)的升汞溶液消毒3～5min，之后用无菌水冲洗6～8遍。