[发明专利]一种秋茄RNA的提取方法

说明书

本发明涉及RNA提取的生物科学技术领域，特别是一种秋茄RNA的提取方法。它包含液氮磨样、水浴裂解、沉淀去杂、低速离心、磁珠吸附、洗涤、干燥、转移等步骤，它通过改良磁珠纯化核酸的方法实现秋茄RNA的纯化，其目的是为了提供一种能够提取高质量的秋茄RNA的提取方法，与现有技术相比，它不需要使用氯仿等管制危险化学品，同时，提取率和纯度都有大幅度提高。

技术领域

本发明涉及RNA提取的生物科学技术领域，特别是一种秋茄RNA的提取方法。

背景技术

秋茄是红树科秋茄树属植物，红树林的常见品种，果实形状似笔，成熟后跟茄子非常相似。由于受到海水周期性浸淹，秋茄富含单宁酸，被砍伐后会氧化变成红色。秋茄也是最能够耐寒的红树林种类之一，兼具陆地植物群落和海洋植物群落的双重特性，在自然生态平衡中有特殊作用。红树林群落除了在湿地生态系统中具有促进土壤沉积物形成、过滤有机物和污染物以及净化水质等重要作用外，还有抵抗潮汐和洪水冲击、减缓风浪、调节水流以及保护堤岸等功能。

随着现代分子生物学技术的发展，对秋茄的研究越来越深入。秋茄基因组序列已经公布，秋茄转录组测序、基因克隆及表达分析已成为秋茄分子生物学研究的热点，而这些研究的重要前提条件是纯化获得高质量的RNA，因此，建立秋茄高质量RNA提取的方法具有重要意义。

实验室曾采用传统Trizol法对秋茄RNA进行提取，但由于红树林植物的共性特征，秋茄叶片及根系含有大量的多糖多酚类及单宁等次生代谢产物，在核酸分离纯化时，RNA容易被降解，导致难以提取高质量的秋茄RNA(如图1、图2所示)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有RNA提取方法的不足，开发一种秋茄RNA的提取方法，使之能够提取高质量的秋茄RNA。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术解决方案：一种秋茄RNA提取的方法，其特征在于其包含以下步骤：

(1)液氮磨样：取秋茄根系或叶片，放入液氮研磨成粉末，迅速转移不少于100mg粉末至无RNA酶的第一EP管中；加600ul Buffer A，立即涡旋混匀；

所述Buffer A按重量百分比由以下组分组成：

PVP401％-3％，巯基乙醇1％-2％，Na₂S₂O₅1％-2％，NaCl 2％-3％，Tris 1％-1.8％，EDTA-2Na 1.5％-2％，SDS 1％-2％，余量为水溶剂，室温保存；

(2)水浴裂解：将所述第一EP管在50℃水浴30分钟，每隔10分钟颠倒20次。水浴也可以使用一个转子放入50℃烘箱，可以使裂解液充分均匀。

(3)沉淀去杂：加200μl Buffer B，上下颠倒所述第一EP管20次，充分混合；所述Buffer B为5M KAc溶液，保存温度4℃。

(4)低速离心：离心机预冷至4℃，所述第一EP管在5000g离心10min，采用低速离心在去除固体杂质的同时，尽可能保证秋茄RNA不被破坏。

(5)取上清液：转移上清液约450μl到第二EP管，不触动沉淀；

(6)磁珠吸附：加450μl的Buffer C和25μl的磁珠，混合倒管20次，将所述第二EP管在室温孵育5分钟，轻离心1s，放置在磁力架上大约3min，直到溶液变清；吸去上清液，不触动磁珠；

所述Buffer C按重量百分比由以下组分组成：PEG8000 20％-25％，NaCl 15％-20％，余量为水溶剂，室温保存；

(7)洗涤：向所述第二EP管加入1ml Wash Solution，从所述磁力架上取下所述第二EP管，颠倒20次，轻离心1s，将所述第二EP管放置在所述磁力架上约30s，吸去上清液，不触动磁珠；