[发明专利]一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法

说明书

本发明属于生物与新医药技术领域，公开了一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化后，用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，放入培养箱中；当细胞密度到培养皿面积的80％‑90％，用ACCTUSE酶消化后，按照(1：5)‑(1：10)的比例传到提前包被的培养皿中。本发明通过开发新的的培养条件，可以实现食蟹猴多能干细胞在无饲养层条件下的培养，无需饲养层的制备节省大量的人力物力，培养成分明确，可以长期保持食蟹猴多能干细胞的多能性。本发明的无饲养层培养食蟹猴干细胞的方法，无批次检影响，有助于提高实验的准确性，培养体系可被临床借鉴。

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域，尤其涉及一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法。

背景技术

目前，培养食蟹猴的多能干细胞培养都需要饲养层提供部分营养，饲养层由12.5天的小鼠胚胎制成，需要将CF-1品系的小鼠交配后在第12.5天取出胚胎，将内脏、四肢和头部去除后，将剩余的组织消化成单细胞培养，待细胞增殖，即可当作饲养层。因此饲养层的制备需要花费大量的人力物力，并且饲养层由于含有动物源成分，培养基成分不确定，容易产生性能不稳定的情况，造成前后批次结果不一致，培养基的质量不稳定和不规范，直接影响研究结果的准确性。在人的多能干细胞和小鼠的多能干细胞培养中，科学家为了解决饲养层带来的影响，开发了新的培养体系，可以满足在不需要饲养层的情况下培养人和小鼠的多能干细胞。但是截止目前为止，针对食蟹猴无饲养层干细胞培养的培养体系还没有较好的开发，因此，亟需一种新的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有饲养层的制备需要花费大量的人力物力，并且饲养层由于含有动物源成分，培养基成分不确定，容易产生性能不稳定的情况，造成前后批次结果不一致，培养基的质量不稳定和不规范，直接影响研究结果的准确性。

解决以上问题及缺陷的难度为：摸索一种新的培养方法需要较多的人力和物力，并且在专业知识上也需要有一定的储备。需要在培养体系的成份和浓度中进行较多的探索，因此需要对培养体系成份大量的筛查。

解决以上问题及缺陷的意义为：如果能解决食蟹猴干细胞无饲养层培养的难题，将有助于非人灵长类干细胞的开发，比如类器官的培养。也能为人多能干细胞的培养体系提供新的参考。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法。

本发明是这样实现的，一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，所述对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法包括：

将在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化；

用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，放入培养箱中；

用ACCTUSE酶消化后，传到提前包被的培养皿中；当细胞密度到培养皿面积的80％-90％，用ACCTUSE酶消化后，传到提前包被的培养皿中；

细胞用ACCTUSE酶消化后，按照1：5-1：10的比例传到提前包被的培养皿中。

进一步，所述对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法包括以下步骤：

步骤一，将在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化；首先将10mg/ml的胶原酶溶液吸取50ul进入提前准备好的1ml干细胞培养基中，混匀后弃掉培养皿中原有的培养基，加入含有胶原酶的培养基。放入培养箱，等待10-15min。等待发现克隆边缘卷起，弃掉培养皿里的培养基，用新的培养基将克隆脱离培养皿。将混有克隆的培养基转移到15ml离心管中，1000rpm，5min离心。

步骤二，取出步骤一中离心的离心管，弃上清，用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，添加促进细胞贴壁因子 CloneR(Stemcell)后放入培养箱中；