[发明专利]一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法

权利要求书

1.一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，其特征在于，所述对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法包括：

将在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化；

用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，放入培养箱中；

用ACCTUSE酶消化后，传到提前包被的培养皿中；当细胞密度到培养皿面积的80％-90％，用ACCTUSE酶消化后，传到提前包被的培养皿中；

细胞用ACCTUSE酶消化后，按照1：5-1：10的比例传到提前包被的培养皿中。

2.如权利要求1所述的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，其特征在于，所述对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法包括以下步骤：

步骤一，将在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化；首先将10mg/ml的胶原酶溶液吸取50ul进入提前准备好的1ml干细胞培养基中，混匀后弃掉培养皿中原有的培养基，加入含有胶原酶的培养基。放入培养箱，等待10-15min。等待发现克隆边缘卷起，弃掉培养皿里的培养基，用新的培养基将克隆脱离培养皿。将混有克隆的培养基转移到15ml离心管中，1000rpm，5min离心。

步骤二，取出步骤一中离心的离心管，弃上清，用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，添加促进细胞贴壁因子CloneR(Stemcell)后放入培养箱中；

步骤三，当细胞密度到培养皿面积的80％-90％，弃掉原来的培养基，加入ACCTUSE(Gibco)放入培养箱中等待5-10min，待细胞消化成单细胞后，用新鲜培养基重旋培养皿中的细胞，然后将含有消化的细胞转移到提前准备好干净的15ml离心管中，1000rpm，5min离心后，去离心管中的上清，用新鲜培养基重旋底部的细胞，添加添加促进细胞贴壁因子CloneR(Stemcell)后，传到提前包被的培养皿中。

3.如权利要求1所述的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，其特征在于，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(L-谷氨酰胺的替代品)(Gibco,100X)0.5ml,Recombinant HumanNodal Protein(重组人的Nodal蛋白)(RD system)5ug,chemically defined lipidconcentrate(化学成分确定的脂质浓缩物)(Gibco)0.5ml,Glutathione(谷胱甘肽)(Sigma)1.94mg/L,LIF(白血病抑制因子)(peprotech)0.4ul/ml-3ul/ml。

4.如权利要求1所述的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，其特征在于，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X)0.5ml,Recombinant HumanNodal Protein(RDsystem)5ug,chemically defined lipid concentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)(proteintech)4ng/ml-20ng/ml。

5.如权利要求1所述的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，其特征在于，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X)0.5ml,N2supplement(N-2添加剂基于Bottenstein’s N-1配方，是一种化学成分确定的无血清添加剂)(Thermo FisherScientific)250ul,B27 supplement(B-27补剂是一种优化的无血清补剂)(Thermo FisherScientific)500ul。