[发明专利]一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂，属于生物技术领域。该间充质干细胞的分离方法包括以下步骤：将滑膜组织剪碎，并置于完全培养基中后，再添加胶原酶溶液进行消化、震荡分散，得到沉降组织和第一上清液；将沉降组织置于完全培养基中进行震荡分散，重复两遍，所得上清液均与第一上清液进行混合，再对上清液进行过滤，得到滤液；将滤液进行离心处理，弃上清，分离得到原代间充质干细胞。将原代间充质干细胞通过2D纯化培养后进行3D扩增培养，获得大量纯度高、分化能力强的滑膜间充质干细胞。本发明提供的间充质干细胞的分离和培养方法，采用的试剂较少，避免了多种酶混合消化对细胞造成的多次损伤。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂。

背景技术

骨关节炎为中老年常见病，骨关节炎严重降低了老年人的生活质量，同时也给社会经济医疗保健带来沉重的负担，研究骨关节炎的治疗方法已成为解决我国民生大计的重要内容之一。骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨的磨损、破坏、丢失，并伴有关节周围骨质增生的一种退行性疾病，主要表现为关节疼痛及功能障碍，目前的治疗手段仅起到缓解的效果，不能有效逆转其进展。

研究发现，OA患者滑膜中广泛分布着表达间充质干细胞(mesenchymal stemcells ，MSCs)标志物的细胞，而在健康关节滑膜中这种细胞仅分布在衬里层。已证实，滑膜间充质干细胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）除具有MSCs的共性外，相比其他来源的MSCs有更好的成软骨分化能力，以及更强的集落形成和扩增能力。此外，滑膜组织具有很强的自我修复能力，即便受到一定的手术创伤或化学损伤，滑膜组织也能够完全恢复，且不会对关节的正常结构和功能等产生十分明显的影响。所以，利用SMSCs治疗OA，采集标本时，以不损伤患者关节正常结构和功能为前提，可以在微创手术（关节镜）过程中获得所需的滑膜组织。动物来源（包括大鼠滑膜和兔滑膜等）的SMSCs已应用于同种异体组织工程动物模型的实验研究中，在动物软骨缺损最深层，SMSCs分化为骨细胞，次深层分化为肥大的软骨细胞，且新生组织与固有软骨融合良好，组织学评分逐渐升高；也有报道移植SMSCs后，SMSCs分泌了大量软骨基质，骨膜处的软骨祖细胞能分泌少量软骨基质。进一步研究发现滑膜间充质干细胞修复形成的组织是透明软骨而非纤维软骨，并且滑膜间充质干细胞更能适应关节内的微环境。说明SMSCs对于软骨损伤具有天然且有效的修复能力，是彻底根治OA的极为有效的理想选择，有必要对其进行提取制备及深入研究。

目前对于SMSCs的研究很少，文献报道的分离提取SMSCs的方法不尽相同，也没有统一的分离制备标准，且现有分离提取SMSCs的方法存在培养周期长，产量低，所采用试剂较多等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种间充质干细胞的分离方法，其包括以下步骤：

将滑膜组织剪碎，并置于完全培养基中后，再添加胶原酶溶液进行消化、震荡分散，得到沉降组织和第一上清液。

将沉降组织置于完全培养基中进行震荡分散，得到上清液与第一上清液混合。

将沉降组织再次置于完全培养基中进行震荡分散，得到上清液与上述上清液混合。

对所得上清液进行过滤，得到滤液。

将滤液进行离心处理，弃上清，得到原代间充质干细胞。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述胶原酶溶液的制备方法包括以下步骤：将胶原酶溶解于完全培养基中后，再经滤膜过滤，得到所述胶原酶溶液。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述胶原酶溶液中，胶原酶的质量与完全培养基的体积的比值以g/mL计为(0.5~1.5):100。