[发明专利]一种自由流等电聚焦电泳缓冲体系

说明书

本发明提供了一种自由流等电聚焦电泳缓冲体系，包括：缓冲体系组分，所述缓冲体系组分设有9个，9个组分包括1个阳极电解液、1个阳极占位缓冲液、5个分离缓冲液和1个阴极占位缓冲液、1个阴极极电解液，所述缓冲体系组分中不含甲基纤维素等大分子物质，pH组成为5‑10.5，等电点在200‑10000us之间。本缓冲体系在异构体制备完成后可采用超滤浓缩管进行回收，回收率可以达到90％以上；本缓冲体系不仅灵敏度较高可以达到0.03pH单位，而且可以明显提高异构体的回收率，降低异构体的后续纯化时间。

技术领域

本发明属自由流等电聚焦电泳技术领域，具体涉及一种自由流等电聚焦电泳缓冲体系。

背景技术

电荷异构体分析是生物治疗蛋白质的一项监管要求。这些大的异质分子在生产过程中历经多种酶促翻译后修饰，例如糖基化和赖氨酸切断。此外，在纯化和储存过程中可发生多种化学修饰，例如氧化或脱氨。自由流电泳是制备蛋白质药物电荷异构体的最佳方法。

自由流电泳(Free Flow Electrophoresis，FFE)是半制备型分离技术，具有可连续分离、多种分离模式、无固定支持介质和分离条件温和等优势，特别适用于生物材料的分离纯化和制备。自由流等电聚焦电泳(IEF-FFE)利用连续流动的两性电解质溶液，在分离室内的电场方向形成线性pH梯度。样品随溶液纵向流动，并在电场作用下发生横向偏转，达到其等电点处不再横向移动，被强制聚焦在某位置，不受扩散和对流的影响，仅在溶液流动方向移动。具有不同等电点的蛋白质或肽等良性物质可通过IEF-FFE达到分离。由于电荷异构体的产生会影响药物的活性，因此现在制备电荷异构体主要是进行活性的分析，但是采用IEF-FFE制备电荷异构体后的缓冲液中存在甲基纤维素或羟甲基丙基纤维素等大分子，这些分子不仅影响异构体的浓缩回收和后续的活性分析，现在常用的纯化异构体的方法是进行亲和层析，由于酸性和碱性异构体含量较少，在亲和层析过程中回收过低而造成实验失败。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自由流等电聚焦电泳缓冲体系，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种自由流等电聚焦电泳缓冲体系，包括：缓冲体系组分，所述缓冲体系组分设有9个，9个组分包括1个阳极电解液、1个阳极占位缓冲液、5个分离缓冲液和1个阴极占位缓冲液、1个阴极极电解液，所述缓冲体系组分中不含甲基纤维素等大分子物质，pH组成为5-10.5，等电点在200-10000us之间。

优选的，所述阳极电解液为100mM硫酸，400mM吡啶乙醇。

优选的，所述阳极占位缓冲液为100mM磷酸，400mM吡啶乙醇，50mM乙二酸。

优选的，5个分离缓冲液分别设为分离缓冲液Ⅰ、分离缓冲液Ⅱ、分离缓冲液Ⅲ，分离缓冲液Ⅳ和分离缓冲液Ⅴ，所述分离缓冲液Ⅰ为20M HIBA，20mMES，20mM HEPES，1.5％pharmalyte8-10.5，1％pharmalyte 5-8，0.5％pharmalyte 2.5-5；所述分离缓冲液Ⅱ为100mM牛磺酸，2％pharmalyte8-10.5，1％pharmalyte 5-8；所述分离缓冲液Ⅲ为1.5％pharmalyte8-10.5，0.1％pharmalyte 5-8；所述分离缓冲液Ⅳ为2％pharmalyte8-10.5，0.1％pharmalyte 5-8，50mM乙醇胺；所述分离缓冲液Ⅴ为300mM KOH，100mM乙醇胺。

优选的，所述阴极占位缓冲液为150mM KOH，50mM乙醇胺，400mM EACA。

优选的，所述阴极电解液为100mM NaOH，400mM EACA。

本发明的技术效果和优点：本缓冲体系在异构体制备完成后可采用超滤浓缩管进行回收，回收率可以达到90％以上；本缓冲体系不仅灵敏度较高可以达到0.03pH单位，而且可以明显提高异构体的回收率，降低异构体的后续纯化时间。

附图说明