[发明专利]重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法

说明书

本发明提供了一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法,包括：利用大肠杆菌密码子的偏好性对重组人纤连蛋白进行密码子优化，构建重组表达载体。利用基因工程方法进行表达纯化，通过AKTA纯化仪使用PMB柱除细菌内毒素。经通过本发明的技术方案，重组人纤连蛋白纯化时间短，表达量高，纯度可达94%‑96%，细菌内毒素含量低，更具安全性，同时稳定性较好，也具有促进细胞增殖活性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，特别涉及一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法。

背景技术

纤连蛋白（fibronectin，英文缩写FN）是一种在血液、间质外基质和细胞周基质中发现的关键黏附蛋白，是一种大分子糖蛋白，其分子量大约是440KD，由几乎两个相同的单体通过C末端二硫键相连。主要包括三种类型：I型、II型、III型。其中I型和II型含有链内二硫键，III型不含二硫键，使其在外力作用下可以部分展开。纤维连接蛋白（FN），其主要功能是增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连，在调节细胞粘附、迁移、增殖等过程中发挥重要作用。

现有的FN大多数是动物的血液或组织中提取的天然的纤连蛋白，其产量有限、成本昂贵，限制了纤连蛋白的生产和在医疗、美容方面的应用。由于FN分子量太大（由2000多个氨基酸组成），难以被皮肤吸收。利用基因工程技术构建出与天然纤连蛋白在功能上相似的小分子重组纤连蛋白，有效解决了天然纤连蛋白分子过大难以生产的缺点，同时还保留了纤连蛋白活性，降低生产成本。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：1.一种重组人纤连蛋白（rhFN），其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述制备方法具体包括以下步骤：

S1:表达；将重组质粒rhFN-pET28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-rhFN；经卡那霉素抗性LB平板筛选的阳性转化子，接种至10mL卡那霉素抗性LB培养基中过夜培养；

S2：诱导；次日进行转接，培养至对数生长期加入诱导剂IPTG进行诱导发酵，20℃诱导16小时，离心收集菌体；

S3:鉴定；S2的诱导过程中对未诱导菌液、诱导完成的菌液分别取样1.5mL，4℃、12000×g、5min离心收集菌体，1.5mLPBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000×g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况；

S4：纯化；使用AKTA纯化仪，连接Ni-NTA柱，采用分步洗脱的方法进行纯化，低温破碎菌体，离心收集上清，经亲和层析纯化得到重组人纤连蛋白；

S5：去除毒素；使用AKTA纯化仪，连接PMB柱除细菌内毒素。

作为优选方案，步骤S2中的具体步骤如下：次日按照终OD为0.04转接到700mLLB/瓶培养基中培养至OD600达到0.6~0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导发酵，IPTG为诱导剂，20℃诱导16小时，4℃、大于等于3000×g、40min离心收集菌体，得到菌泥，菌泥获得量为3g/L。

作为优选方案，步骤S4中的具体步骤如下：

S41：菌泥进行重悬，重悬后使用超声破碎仪或高压均质仪破碎菌悬液；

S42：破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、大于等于25000×g、30min，离心收集上清；

S43：离心后的菌液上清使用抽滤装置进行过滤，经过0.22μm滤膜过滤后作为蛋白原液进行后续试验；