[发明专利]邻苯二酚双加氧酶突变体、重组载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种邻苯二酚双加氧酶突变体、重组载体及其制备方法和应用，该突变型邻苯二酚双加氧酶为如下(a1)或(a2)：(a1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有相同功能的多肽；(a2)与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。本发明的突变型邻苯二酚双加氧酶包括单点突变体和组合突变体，与野生型邻苯二酚双加氧酶相比，其单点突变体和组合突变体在40℃下半衰期均更长；尤其是组合突变体，其半衰期大约是野生型的3倍，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种邻苯二酚双加氧酶突变体、重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，工业废水污染造成的环境问题备受关注。在这些污水中，芳香化合物占具较高比例，而芳香化合物是一类难以降解的有机物质，对人体具有毒害作用，如致癌、神经毒性等。自然界中，存在着许多具有降解芳香族化合物能力的细菌，如Acinectobactercalcoaceticu、Pseudomonas sp.、Acine tobacter lwoffii、Burkholderia sp.等，可将芳香族化合物作为唯一生长碳源，并完全降解为H₂O和CO₂。邻苯二酚是芳香化合物降解过程中的一个重要中间产物，而邻苯二酚双加氧酶是催化降解过程的关键酶，主要通过邻位或间位双加氧酶的作用裂解邻苯二酚生成粘康酸半醛或粘康酸，从而使苯环断裂。随着分子生物学技术的发展，虽然已有很多关于邻苯二酚双加氧酶基因表达方面的研究，但由于其降解对象均为性质稳定的芳香化合物，一些邻苯二酚双加氧酶表现出较低的热稳定性，限制了其工业化应用的过程。因此，有必要对现有邻苯二酚1,2-双加氧酶进行酶定向进化改造，提高其热稳定性，从而提升其降解芳香化合物的效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种邻苯二酚双加氧酶突变体、重组载体及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种突变型邻苯二酚双加氧酶(CatA)，所述突变型邻苯二酚双加氧酶为如下(a1)或(a2)：

(a1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有相同功能的多肽；

(a2)与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。

研究发现，上述(a1)和(a2)两者类型的突变型邻苯二酚双加氧酶具有较高的酶稳定性。经试验验证，该突变型邻苯二酚双加氧酶酶的半衰期最高能得到3倍的提升。

优选的是，所述突变型邻苯二酚双加氧酶是在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列上进行突变得到的，突变位点选自A95V、L148S、R193Q、L248D中的一种或一种以上的组合。

优选的是，所述突变位点为A95V、L148S、R193Q、L248D、A95V-L14 8S、L148S-R193Q、A95V-L248D、R193Q-L248D、A95V-R193Q、L148S-L2 48D、A95V-L148S-R193Q、A95V-L148S-L248D、A95V-R193Q-L248D、L14 8S-R193Q-L248D或A95V-L148S-R193Q-L248D。

优选的是，A95V单位点突变对应的突变型邻苯二酚双加氧酶的氨基酸序列如SEQID No.3所示；

L148S单位点突变对应的突变型邻苯二酚双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

R193Q单位点突变对应的突变型邻苯二酚双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；