[发明专利]卵母细胞冷冻保存液及磁场低温保存卵母细胞的方法

说明书

本发明公开了一种卵母细胞冷冻保存液及磁场低温保存卵母细胞的方法。本发明通过在卵母细胞冷冻保存液中添加海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒，并在磁场下低温保存鼠卵母细胞，实现了对卵母细胞的冷冻保存方法的优化，在冷冻保存小鼠卵母细胞、胚胎时，不仅克服了现有技术的诸多缺陷，而且保存效率显著提高。

技术领域

本发明涉及一种卵母细胞的保存方法，特别涉及一种卵母细胞冷冻保存液及磁场低温保存卵母细胞的方法，属于卵母细胞冷冻技术领域。

背景技术

卵母细胞冷冻保存可以使年龄偏大的女性、患有癌症的女性及患有精神、生理并发症的女性通过冻存卵母细胞来保存生育能力。利用卵母细胞冷冻保存技术建立“卵子库”不仅可以解决卵母细胞来源短缺问题，还可以使体外受精不受时间和空间的限制。因此，如何高效的冷冻保存卵母细胞是亟待解决的科学技术问题。

目前最常用的卵母细胞冷冻保存方法为玻璃化冷冻法，其优点是操作简单快捷、降温迅速，降温过程中卵母细胞内外溶液呈玻璃态，避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤，但是冻融后的卵母细胞的存活率、形态正常率、受精率和发育力等有所下降。有研究表明，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞，且玻璃化冷冻时添加高浓度的冷冻保护剂容易引起化学中毒。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种磁场低温保存卵母细胞的方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例的一个方面提供了一种卵母细胞冷冻保存液，包括玻璃化冷冻液，所述玻璃化冷冻液包含含量0且≦1wt％的海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，所述玻璃化冷冻液可以采用已知的适用于冷冻保存卵母细胞的玻璃化冷冻液，其可以通过市场购买等途径获取。

在一些实施方式中，所述海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

(1)制备油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(2)以异柠檬酸对油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒表面进行改性，制得水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(3)以海藻糖对所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒进行表面修饰，获得海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，步骤(1)包括：将摩尔比为(0.8～1)：2的FeCl₂和FeCl₃溶解在纯水中，在温度为60～65℃和氮气保护条件下搅拌至得到黄绿色澄清溶液，再调节该黄绿色澄清溶液的pH值为9.0～9.5，继续在温度为58～65℃和氮气保护条件下反应40min以上，其中采用的搅拌速率为400r/min以上，制得油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，步骤(2)包括：将所述油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒洗涤后分散于异柠檬酸溶液中，超声至形成均匀透明的稳定体系，从而制得水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，步骤(3)包括：将纯度高于95wt％的海藻糖加入含有所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的水相溶液中，在3～10mT交变磁场下搅拌15～25min，然后加热至80～90℃，回流反应1～3h，之后除去残余的异柠檬酸和海藻糖，获得海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，所述海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒的核粒径为5～30nm。