[发明专利]卵母细胞冷冻保存液及磁场低温保存卵母细胞的方法

权利要求书

1.一种卵母细胞冷冻保存液，包括玻璃化冷冻液，其特征在于，所述玻璃化冷冻液包含含量0且≦1wt％的海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

(1)制备油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(2)以异柠檬酸对油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒表面进行改性，制得水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(3)以海藻糖对所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒进行表面修饰，获得海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，步骤(1)包括：将摩尔比为(0.8～1)：2的FeCl₂和FeCl₃溶解在纯水中，在温度为60～65℃和氮气保护条件下搅拌至得到黄绿色澄清溶液，再调节该黄绿色澄清溶液的pH值为9.0～9.5，继续在温度为58～65℃和氮气保护条件下反应40min以上，其中采用的搅拌速率为400r/min以上，制得油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒。

4.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，步骤(2)包括：将所述油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒洗涤后分散于异柠檬酸溶液中，超声至形成均匀透明的稳定体系，从而制得水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，步骤(3)包括：将纯度高于95wt％的海藻糖加入含有所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的水相溶液中，在3～10mT交变磁场下搅拌15～25min，然后加热至80～90℃，回流反应1～3h，之后除去残余的异柠檬酸和海藻糖，获得海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于：所述海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒的核粒径为5～30nm。

7.一种磁场低温保存卵母细胞的方法，其特征在于包括：

在交变磁场或静磁场中，将卵母细胞依次在冷冻平衡液、冷冻保存液中放置，之后置入液氮中保存；所述冷冻保存液采用权利要求1～6中任一项所述的卵母细胞冷冻保存液。

8.根据权利要求7所述的磁场低温保存卵母细胞的方法，其特征在于具体包括：在交变磁场或静磁场中，将卵母细胞先在冷冻平衡液放置2～5min，之后在冷冻保存液中放置1～3min，最后置入液氮中保存。

9.根据权利要求7所述的磁场低温保存卵母细胞的方法，其特征在于：所述交变磁场的强度为3～20mT，频率为50～200Hz；所述静磁场的强度为3～20mT。

10.根据权利要求7所述的磁场低温保存卵母细胞的方法，其特征在于：所述冷冻平衡液包括2～3％(v/v)乙二醇、1～1.5％(v/v)二甲基亚砜、1～1.5％(v/v)丙二醇和1～1.5％(w/w)乙酰胺，余量为Earle's平衡盐溶液。