[发明专利]一种基于膜吸附的黄瓜基因DNA快速提取扩增方法

说明书

本发明公开了一种基于膜吸附的黄瓜基因DNA快速提取扩增方法，所述提取扩增方法包括以下步骤：（1）黄瓜果实的切碎与裂解；（2）滤膜片的制备与基因DNA吸附；（3）滤膜片的清洗；（4）滤膜片吸附DNA在PCR反应液中的洗脱；（5）PCR扩增与产物电泳。本方法可以从黄瓜的表皮、表层果肉和中心果肉中稳定提取基因DNA进行扩增，操作简单，成本低，提取快速，可以在10分钟内提取适用于扩增的黄瓜基因DNA，适用于黄瓜基因的快速鉴定与分析。

技术领域

本发明涉及黄瓜基因DNA提取扩增技术领域，特别是涉及一种黄瓜基因DNA快速提取扩增方法。

背景技术

黄瓜是遍布世界的重要蔬菜，黄瓜基因组计划已经完成，各种基因组学研究方法正在如火如荼展开，特别是对黄瓜基因组的改造，在抗病性、抗虫害、抗逆性、抗除草剂、品质改良等方面进行了许多研究，得到了多种性状优良的品种，但是为了更好地品种确证，对黄瓜特定基因的鉴定与分析是常用的实验方法。

在黄瓜特定基因的鉴定与分析中，首先提取黄瓜基因DNA。目前常用的提取方法是CTAB法和SDS法，一般以新鲜叶片为原材料，需要研磨等步骤，较为费时费力，而且在市场上销售的黄瓜也很难找到叶片。商品化试剂盒多采用二氧化硅吸附离心法与磁珠吸附法。在二氧化硅吸附离心法中，在高浓度超离液盐（chaotropic salt）存在的情况下核酸与固体二氧化硅支撑物结合，然后通过一系列清洗和离心步骤去除杂质，最后在低浓度盐溶液中从二氧化硅洗脱核酸。而磁珠吸附法是在磁珠表面进行官能团修饰，实现与核酸结合，然后利用磁铁吸附磁珠来进行分离和清洗杂质，然后将磁珠上的核酸洗脱。

滤膜（cellulose membrane）吸附法也可以用于核酸的提取，修饰后的滤膜可以从人血液里提取基因组DNA，也可以在多种生物体里实现核酸快速提取，还可以用于法医中DNA证物的长期保存。膜吸附法操作简便，不需要离心机、磁铁等辅助设备，具有很大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于膜吸附的黄瓜基因DNA快速提取扩增方法。

本发明采用的黄瓜基因DNA快速提取扩增方法原理如图1所示，取黄瓜果实表皮、表层果肉或者中心果肉10-100mg，放入小管中，用镊子捏碎，直至无明显大块果实，加入100μL裂解液，充分混匀，室温孵育1分钟。放入制备好的滤膜片，室温作用1分钟；将滤膜片取出后放入盛有清洗液的小管进行清洗，室温作用1分钟；将滤膜片取出放入配制好的PCR反应液中，室温孵育1分钟，去除滤膜片，进行核酸扩增，扩增后产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

基于膜吸附的黄瓜基因DNA快速提取扩增方法，包括以下步骤：

（1）黄瓜果实的切碎与裂解；

（2）滤膜片的制备与基因DNA吸附；

（3）滤膜片的清洗；

（4）滤膜片吸附DNA在PCR反应液中的洗脱；

（5）PCR扩增与产物电泳。

其中，所述黄瓜果实的切碎与裂解是取黄瓜果实表皮、表层果肉或者中心果肉10-100mg，放入小管中，用镊子捏碎，直至无明显大块果实，加入100μL裂解液，充分混匀，室温孵育1分钟。

其中，所述黄瓜果实裂解过程中使用的裂解液配制步骤如下：如配制1L裂解液，依次加入100mL 8M盐酸胍（终浓度：800mM），100mL 500mM Tris[pH 8]（终浓度：50mM），0.5mLTriton X100，1mL Tween-20，用纯净水定容到1L。

其中，所述滤膜片的制备如下，选择符合如下特征的滤膜：纤维素含量≥98%，孔径≈10μm，厚度≈200μm，过滤速度≈150s。将滤膜片裁剪成2-3mm直径的圆片。，裁剪为2-3mm直径的圆片，置于干燥处。