[发明专利]一种MSC分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统，S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备；S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞；S3：间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞。其中，使用经过玻连蛋白和重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用特殊的无动物源性外周神经诱导培养基、无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基及无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基，工艺整体优化，培养基化学成分明确，在培养基的质量控制和终产品的质量控制上有明显优势，工艺整体可做到无动物源性，避免了动物源性致病因子污染风险，适用于大的表面面积的细胞培养器皿，加大了每个批次的雪旺氏细胞产量，有利工业化生产。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种MSC分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统。

背景技术

雪旺氏细胞(Schwann cells，以下简称SC)是一种具有促进神经再生能力的细胞，在疾病治疗、科学研究等领域有巨大应用潜力，疾病治疗和药物研发都需要大量高纯度的SC。SC的现有获得方法主要分为两种：组织提取法和干细胞分化法。组织提取法通过提取健康供者的外周神经组织，提取其中的SC，再通过体外培养获得足够数量的SC用于治疗。干细胞分化发通过体外分化手段，将间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)、胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)或诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)分化为SC。然而，组织提取法无可避免会对供者的外周神经系统造成损伤，并且获得的SC数量有限、有批次间差异，难以广泛应用到临床。另一方面，现有的体外分化方法大多工艺不成熟、使用化学成分不完全明确的培养基，对培养基关键成分的浓度也未有深入研究，所得到的SC批次间质量差异较大，不利工业生产，限制了SC细胞的应用。分化过程所使用的试剂和物料包含了牛血清白蛋白、鼠源细胞分泌物(基质胶，Matrigel)等大量的动物源性物料。因上述情况，以现有干细胞分化法制备得到的SC，和工业规模生产和实际临床应用仍有较大的距离。另一方面，ESC本身的获得需要消耗胚胎组织，有一定的道德争议。此外，现有技术多用于科学研究，未尝试摸索SC大量生产的方法，未能满足工业生产和治疗应用的需求。

综上，目前SC的获得途径有限，制备工艺步骤欠成熟，使用化学成分不完全明确、含动物源性成分的试剂和培养基，所得到的SC批次间质量差距较大，制备成本高、产量低，局限了其应用，亟需一种制备过程简化、制备时间短、成本低、污染风险小、产量和纯度高、利于工业化生产的分化方法和培养基。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种MSC分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统，S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备；S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞；S3：间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞。其中，使用经过玻连蛋白和重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用特殊的无动物源性外周神经诱导培养基、无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基及无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基。

本发明提供一种间充质干细胞分化为雪旺氏细胞的方法，包括如下步骤：

S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备，具体包括以下步骤：

(a)分离间充质干细胞，原代培养；

(b)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；

(c)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；

(d)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞，获得的神经前体细胞将进一步分化为雪旺氏细胞；所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。

S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞，具体包括以下步骤：