[发明专利]一种MSC分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统

权利要求书

1.一种间充质干细胞分化为雪旺氏细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备，具体包括以下步骤：

(a)分离间充质干细胞，原代培养；

(b)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；

(c)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；

(d)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞，获得的神经前体细胞将进一步分化为雪旺氏细胞；所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。

S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞，具体包括以下步骤：

(e)诱导多能干细胞的培养；

包括原代培养和传代培养，所述原代培养和所述传代培养中所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；

(f)诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞；

将诱导多能干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01进行培养，更换培养基，培养8～10天，对诱导多能干细胞分化后得到的外周神经干细胞进行处理，收集外周神经干细胞。

(g)外周神经干细胞进一步分化为外周神经元细胞；

将外周神经干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02进行培养，每隔24～36小时更换培养基，在培养10～12天后对外周神经元细胞进行分析，检测其纯度和产量。所得到的外周神经元细胞辅助间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞。

S3：间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞；

将所述步骤S1获得的神经前体细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培器皿，以无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01培养8～10天后，收集细胞，接种到经过重组层粘连蛋白处理，并且已经接种有步骤S2获得的诱导多能干细胞来源的外周神经元的培养器皿，以无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02培养12～15天，处理并收集雪旺氏细胞进行第一轮分析，再在无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基培养后进行第二轮分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无动物源性外周神经诱导培养基-01包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、LDN193189、SB431542、CHIR99021、RO4902097、SU5402、全反式维生素A酸、Y27632；所述无动物源性外周神经诱导培养基-02包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、脑源性神经营养因子、神经生长因子、Y27632、5-氟-2’-脱氧尿苷。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、全反式维生素A酸；所述无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02包括以下成分：神经元培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、神经生长因子。