[发明专利]一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法包括以下步骤：

步骤一，按照质量份数称取牛脑浸粉3～5份、牛心浸粉3～5份、酪蛋白胨6～8份、蛋白胨4～6份、酵母粉1-2份、葡萄糖2～3份、氯化钠4～5份、磷酸氢二钠2～3份、琼脂12～15份、无菌蒸馏水1000份，混合后搅拌均匀得到混合物料；将混合物料进行加热直至充分溶解，高温灭菌后进行静置、冷却，得到脑心浸液琼脂培养基；将分离自发病海水鱼体内并具有强毒力和良好免疫原性的海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养；脑心浸液培养基成分1000份中包括：牛脑浸粉4.0份、牛心浸粉4.0份、蛋白胨5.0份、酪蛋白胨16.0份、氯化钠5.0份、葡萄糖2.0份、磷酸氢二钠2.5份、酵母粉1份、小牛血清1份；

步骤二，将步骤一所述脑心浸液琼脂培养基上培养好的菌苔接种于高压灭菌且盛有500mL脑心浸液培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养；所述在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养的条件为：设置小体积的液体活化培养的温度为28±0.5℃，摇床转速为120～180r/min，活化培养时间为18～h；

步骤三，将步骤二得到的活化培养好的菌体按照2～4％的比例接种于生物反应器中已经高压灭菌的30L发酵培养基中通气搅拌培养，当链球菌生长到10⁸或10⁹CFU/mL时，停止发酵反应；所述将活化培养好的菌体接种于生物反应器中已经高压灭菌的发酵培养基中通气搅拌培养的条件为：于温度为28±0.5℃、通气量为100～150L/min的条件下搅拌培养12～14h；步骤四，将得到的链球菌接种于300L发酵培养基，于28±0.5℃、180～200r/min、通气量为250～300L/min的条件下培养12～14h后，取样，测定菌液A600值，直到菌液A600开始下降，停止发酵反应；

步骤五，将经步骤四发酵反应得到的链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或是离心浓缩，收集菌体，重悬，制成灭活链球菌浓缩液；将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀，即得所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗成品。

2.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养的条件为：于28±0.5℃条件下培养20～24h。

3.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述将链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或是离心浓缩，收集菌体，重悬，包括：

(1)将发酵反应得到的链球菌发酵菌液转入灭活罐中，添加终浓度体积分数0.1～0.5％的福尔马林溶液，于28±0.5℃、50～100r/min的条件下灭活24～48h；

(2)使用0.45μm滤膜进行超滤，或是利用离心机离心收集菌体；

(3)用磷酸盐缓冲溶液将收集菌体稀释成浓度为5.0×10⁸～10.0×10⁹CFU/mL灭活上述链球菌浓缩液。

4.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀，包括：

(1)在灭活链球菌浓缩液中加入无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释；

(2)将稀释后的灭活链球菌浓缩液65～80份置于配苗罐中，以50～100r/min的速度搅拌，边搅拌边依次加入15～30份的佐剂和3～5份的辅剂；

(3)搅拌混合10～40min后，在无菌条件下，灌装，即得所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗成品。

5.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、蜂胶、MONTANIDETM ISA763A VG、MONTANIDETM IMS1312VG、MONTANIDETM GEL 01PR中的任意一种或一种以上。